《cr操作規(guī)范》ppt課件-全文預(yù)覽
【正文】 PCR 該法 優(yōu)點(diǎn) ： ① 去除任河來(lái)源 （ 包括引物在內(nèi) ） 的 污染； ② 由于污染的產(chǎn)物有大量 dU存在 ， 因此 ， UNG處理會(huì)徹底消除污染 。 方法同上 ， 只是 DnaseI由內(nèi)切酶 （ MspI10U） 代替 ，作用時(shí)間延長(zhǎng)到 ～ 。UV對(duì)長(zhǎng)片段（ 500bp以上）有效，而對(duì)短片段效果不大。 追蹤可疑的環(huán)境污染源 ① 用去離子浸濕的滅菌棉簽擦試可疑部分 ② 在 去離子水中浸泡； ③ 取 5μl 作 PCR反應(yīng)； ④ 電泳檢查結(jié)果 。 （ 二 ） 污染源的追蹤 陽(yáng)、陰性對(duì)照 選擇陽(yáng)性對(duì)照時(shí) ， 應(yīng)選擇擴(kuò)增 弱 ， 且 重復(fù)性好 的樣品 。 要防止 PCR污染 ， 必須做好以下 3個(gè)環(huán)節(jié)的工作： （ 一 ） 污染的預(yù)防 （ 二 ） 污染源的追蹤 （ 三 ） 污染源的處理 （一）污染的預(yù)防 操作 PCR時(shí) ， 按照下述規(guī)則可有效地預(yù)防PCR的污染 。 與一般熒光定量 PCR使用熒光強(qiáng)度定量不同，實(shí)時(shí)熒光 PCR一般使用 Ct（每個(gè)反應(yīng)熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定域值所經(jīng)的循環(huán)數(shù)）定量， Ct與模板初始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)成線性關(guān)系。 擴(kuò)增儀孔中熱傳導(dǎo)的 均一性 極為重要。 痰須液化處理。 （三）標(biāo)本的運(yùn)送 可在常溫下通過(guò)郵寄運(yùn)送，如用于DNA擴(kuò)增檢測(cè)的 EDTA抗凝全血及用于RNA擴(kuò)增檢測(cè)的 GITC穩(wěn)定化處理的標(biāo)本。 烘烤 4小時(shí)以上可使 RNA酶永久性失活 。 （一）標(biāo)本的采集 臨床標(biāo)本包括 EDTA或 枸櫞酸鈉 抗凝全血或骨髓 、血清或血漿 、 痰 、 腦脊液 、 尿及分泌物等 。 本區(qū)是最主要的擴(kuò)增產(chǎn)物污染來(lái)源 。 如有加樣則應(yīng)在超凈臺(tái)內(nèi)進(jìn)行 。 （三）擴(kuò)增區(qū) 功能： DNA或 cDNA擴(kuò)增 。 為避免樣本間的交叉污染，加入待測(cè)核酸后，必須 蓋好 含反應(yīng)混合液的反應(yīng)管。 實(shí)驗(yàn)室及其設(shè)備的使用必須有 日常記錄 。 含反應(yīng)混合液的離心管或試管在 冰凍前 都應(yīng)快速離心數(shù)秒 。 4. 使用 不同顏色 或有明顯區(qū)別標(biāo)志的工作服 。 臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)操作規(guī)范 浙 江 省 基 因 診 斷 中 心 浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬兒童醫(yī)院 尚世強(qiáng) 一 、 臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室的 規(guī)范化設(shè)置及其各室的功能 二 、 各階段操作要求 三 、 PCR污染與對(duì)策 四 、 因操作欠規(guī)范導(dǎo)致的問(wèn)題分析 一、臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室的 規(guī)范化設(shè)置及其各室的功能 規(guī)范化設(shè)置： 要求參照《臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室管理暫行辦法》（衛(wèi)醫(yī)發(fā) [2022] 10號(hào)文）附件《 臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室基本設(shè)置標(biāo)準(zhǔn) 》。 3. 單一方向 順序 ， 從試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū) 、 標(biāo)本 制備區(qū) 、 擴(kuò)增反應(yīng)混合物配制和擴(kuò)增區(qū) （ 簡(jiǎn) 稱擴(kuò)增區(qū) ） 至產(chǎn)物分析區(qū) 。 各室功能： （一）試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū) 功能： 貯存試劑的制備、試劑的分裝和主反應(yīng)混合液的制備 。實(shí)驗(yàn)臺(tái)表面，使用可移動(dòng)紫外燈（ 254nm波長(zhǎng)）照射，一般照射過(guò)夜。 正壓條件避免從鄰近區(qū)進(jìn)入本區(qū)的氣溶膠污染。 用于 RNA擴(kuò)增檢測(cè)的樣本制備好以后，應(yīng) 立即 進(jìn)行 cDNA合成。
教學(xué)課件相關(guān)推薦
鄂ICP備17016276號(hào)-1