【正文】 端融合基因的存在，使得外源基因的表達(dá)相對比較容易。 影響翻譯效率的因素主要有： 1) SD序列與 rRNA的 16S亞基 3’端序列的互補程度，是影響翻譯效率的主要因素。 為了使外源基因表達(dá)，需要在基因編碼順序的 5’端有能被宿主細(xì)胞識別的啟動基因順序以及核糖體的結(jié)合順序。 不論基因工程的研究目的如何，最終均涉及到目的基因的表達(dá)問題。 啟動子與結(jié)構(gòu)基因之間的距離在蛋白質(zhì)翻譯上有巨大作用。 翻譯的起始是決定翻譯水平高低的一個重要因素。 6) 融合蛋白是避免細(xì)菌蛋白酶破壞的最好措施。 ? 通過表達(dá)載體將外源基因?qū)胨拗骶?，并指?dǎo)宿主菌的酶系統(tǒng)合成外源蛋白； ? 外源基因不能帶內(nèi)含子，必須用 cDNA，而不能用基因組 DNA； ? 利用原核細(xì)胞的強啟動子和 SD序列等調(diào)控元件控制外源基因的表達(dá)； ? 外源基因與表達(dá)載體連接必須形成正確的開放閱讀框架； ? 利用宿主菌的調(diào)控系統(tǒng)，防止外源基因的表達(dá)產(chǎn)物對宿主菌的毒害。研究表明，大腸桿菌的 “ 重復(fù)性基因外回文序列 ” 具有穩(wěn)定 mRNA的作用，能防止外切酶的攻擊。 ②采用某種突變菌株，保護(hù)表達(dá)蛋白不被降解。 使用釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng)需考慮問題： ①啟動子和終止子的選擇； ②表達(dá)盒的穩(wěn)定性； ③外源蛋白的累積部位； ④產(chǎn)量的提高。 6）糖基化 酵母能進(jìn)行 N糖基化，但主要是甘露糖型；還會發(fā)生過糖基化，而這樣的糖基化會導(dǎo)致潛在免疫性。 PDV可保護(hù)膠囊化的病毒避免熱和干燥等外部因素的破壞，而當(dāng)受感染的昆蟲死后，大量的PDV可以作為寄主分解物釋放出來。 外源蛋白的表達(dá)還要受諸多因素的影響，高質(zhì)量的培養(yǎng)基是獲得高效表達(dá)的前提，昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)要求相對較高的氧濃度以及有高活性且生長在對數(shù)期的細(xì)胞。培養(yǎng)和篩選一個高度擴增的轉(zhuǎn)化子 CHO細(xì)胞，通常需要數(shù)月時間，難度較大。 再生基因由 T7啟動子與 T7RNA聚合酶編碼序列組成。 哺乳動物細(xì)胞表達(dá)體系的優(yōu)越性是，它表達(dá)的高等真核蛋白總是正確地被修飾（二硫鍵的精確形成、糖基化、磷酸化、寡聚體的形成或者由特異性蛋白酶進(jìn)行的裂解等）。 昆蟲表達(dá)系統(tǒng)對蛋白前體的蛋白酶切割能力方面，雖然多數(shù)哺乳動物的分泌信號肽可以在昆蟲細(xì)胞中得到精確處理，但帶有信號肽序列卻未必能分泌成熟蛋白。 一．以重組桿狀病毒為載體的昆蟲表達(dá)體系 重組桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)是在真核環(huán)境中高效表達(dá)外源蛋白的有力工具。 3）轉(zhuǎn)譯錯誤可通過對 DNA修改來防止，如選用酵母合適的密碼子以避免錯誤地插入tRNA和由于使用酵母中稀有密碼子而引起的轉(zhuǎn)譯中斷和移位，以提高正確的產(chǎn)物產(chǎn)量。 用酵母生物技術(shù)方法得到的第一種醫(yī)用產(chǎn)品是乙型肝炎疫苗。當(dāng)宿主菌迅速生長時，抑制質(zhì)粒的復(fù)制；當(dāng)宿主菌生物量積累到一定水平后，再誘導(dǎo)細(xì)胞中質(zhì)粒 DNA的復(fù)制，增加質(zhì)粒的拷貝數(shù)，拷貝數(shù)的增加必然導(dǎo)致外源基因表達(dá)水平的提高。由缺陷性分配引起的質(zhì)粒丟失現(xiàn)象，叫做 質(zhì)粒分離的不穩(wěn)定性 。 另外，生產(chǎn)規(guī)模的包含體變性復(fù)性的產(chǎn)物純化過程，其費用亦相對較高。 所得到的融合蛋白經(jīng)化學(xué)方法或酶法切割開來之后，混合產(chǎn)物再上同一親和柱，充作 “ 親和手柄 ” 的一段多肽或蛋白以及尚未被切開的融合蛋白被吸附于柱上，而重組目的產(chǎn)物則處于流動相中。如果這個區(qū)域是由 4個 A(T)堿基組成，其轉(zhuǎn)譯作用最為有效；而當(dāng)這個區(qū)域是由 4個 C堿基或 4個 G堿基組成，其轉(zhuǎn)譯效率只及最高轉(zhuǎn)譯效率的 50％或 25％。這種融合蛋白質(zhì)被提純后，還要準(zhǔn)確地將兩部分分開，才能獲得所需要的蛋白質(zhì)。第八章 目的基因的表達(dá) 第一節(jié) 基因工程中的基因表達(dá) 一、制約目的基因表達(dá)的因素 二、閱讀框架 三、啟動子的影響 四、終止子的影響 五、翻譯過程對表達(dá)的影響 絕大多數(shù)的基因工程研究是以獲得基因表達(dá)產(chǎn)物為目標(biāo)。 一、制約目的基因表達(dá)的因素 二、閱讀框架 三、啟動子的影響 四、終止子的影響 五、翻譯過程對表達(dá)的影響 原核細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄過程中，決定外源基因表達(dá)的關(guān)鍵因素是外源基因必須在載體 DNA的啟動子控制之下，而且啟動子又能被宿主細(xì)胞中的 RNA聚合酶有效識別。 3) 起始密碼之后的一個核苷酸對 mRNA與核糖體的結(jié)合也有影響；直接位于起始密碼子 AUG左側(cè)的密碼三聯(lián)體的堿基組成，同樣會對轉(zhuǎn)譯的效率發(fā)生影響。這樣，經(jīng)過比較簡單的幾步即得到較高純度的重組目的蛋白。 如何能在大腸桿菌中直接表達(dá)出已正確折疊的有生物活性的重組目的蛋白，引起眾多研究者的興趣，并成為近年來大腸桿菌表達(dá)研究的熱點之一。 （ 6）提高翻譯水平常用的途徑 ①調(diào)整 SD序列與 AUG間的距離； ②用點突變的方法改變某些堿基； ③增加 mRNA的穩(wěn)定性。 例如質(zhì)粒 pCll01的溫度控制誘導(dǎo)復(fù)制。其他類似產(chǎn)品包括組織型血纖維蛋白溶源激活因子、胰島素和水蛭素。 4）要得到有活性的成熟產(chǎn)物，選擇轉(zhuǎn)譯后具修飾能力的酵母及合適的載體。 多核多角體病毒是使用最廣泛的載體，該亞群的原型為苜蓿銀紋夜蛾多核型多角體病毒(AcMNPV)，病毒基因組為共價閉合環(huán)狀雙鏈DNA，長 80～ 200kb。 利用不同哺乳動物細(xì)胞表達(dá)鼠抗人腫瘤壞死因子單鏈抗體時，不能產(chǎn)生分泌表達(dá)，而在昆蟲表達(dá)系統(tǒng)中則可以分泌表達(dá)，這在一定程度上說明，除對信號肽的處理外，其他蛋白酶切割位點的存在數(shù)量及昆蟲對它們的識別能力都與高等真核生物有差異，這些都是表達(dá)活性外源蛋白的制約因素。 如果所表達(dá)的是具有生物學(xué)功能的膜蛋白或分泌性蛋白，如細(xì)胞表面的受體或細(xì)胞外的激素和酶，目前只能由哺乳動物細(xì)胞來表達(dá)。將其與胞漿表達(dá)系統(tǒng)共轉(zhuǎn)染細(xì)胞后， CAT基因的持續(xù)表達(dá)呈再生基因依賴性，至少在 5天內(nèi)CAT基因高效表達(dá)。 缺點是組織培養(yǎng)技術(shù)要求高。昆蟲細(xì)胞中重組蛋白的表達(dá)量在感染的后期可占總蛋白的一半，比大腸桿菌效率要高許多。 多核多角體病毒作載體的優(yōu)點 AcMNPV及組內(nèi)其他