【正文】 20221022 31 目的基因在宿主中的表達(dá) ?包涵體型異源蛋白的表達(dá) ?分泌型異源蛋白的表達(dá) ?融合型異源蛋白的表達(dá) ?寡聚型異源蛋白的表達(dá) ?整合型異源蛋白的表達(dá) ?蛋白酶抗性或缺陷型表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建 20221022 32 目的基因在宿主中的表達(dá) 包涵體型異源蛋白的表達(dá) （ 1）包涵體及其性質(zhì) 在某些生長(zhǎng)條件下，大腸桿菌能積累某種特殊的生物大分子，它們致密地集聚在細(xì)胞內(nèi)，或被膜包裹或形成無(wú)膜裸露結(jié)構(gòu)，這種水不溶性的結(jié)構(gòu)稱為包涵體（ Inclusion Bodies， IB）。 20221022 30 目的基因在宿主中的表達(dá) （ 2）質(zhì)粒擴(kuò)增時(shí)序的控制 pCP3擁有一個(gè)溫度可誘導(dǎo)型的復(fù)制子， 在 28℃ 時(shí)，每個(gè)細(xì)胞的質(zhì)?？截悢?shù)為 60； 在 42℃ 時(shí)，拷貝數(shù)迅速增至 300600。質(zhì)粒分子的過(guò)度增 殖以及其后目的基因的高效表達(dá)勢(shì)必會(huì)影響受體細(xì)胞的生長(zhǎng)代謝，進(jìn) 而導(dǎo)致重組質(zhì)粒的不穩(wěn)定性以及目的基因表達(dá)水平的下降。由此構(gòu)建的大腸桿菌雙質(zhì)粒系統(tǒng)有效地解除了受體細(xì)胞對(duì)外源基因高效表達(dá)的制約作用。 例如，在人尿激酶原 cDNA的 412個(gè)密碼子中，共含有 22個(gè)精氨酸密碼子，其中 7個(gè) AGG、 2個(gè) AGA，而大腸桿菌受體細(xì)胞中 tRNAAGG和tRNAAGA的豐度較低。重組人胰島素、干擾素以及生長(zhǎng)激素在 大腸桿菌中的高效表達(dá)均采用了這種方法。 20221022 25 目的基因在宿主中的表達(dá) Codon Usage Database Aspergillus oryzae Aspergillus niger Saccharomyces cerevisiae Escherichia coli 20221022 26 目的基因在宿主中的表達(dá) （ 2）密碼子偏愛(ài)性對(duì)外源基因表達(dá)的影響 由于原核生物和真核生物基因組中密碼子的使用頻率具有較大程度的差異性，因此外源基因尤其是高等哺乳動(dòng)物基因在大腸桿菌中高效翻譯的一個(gè)重要因素是密碼子的正確選擇。 目前廣泛用于外源基因表達(dá)的大腸桿菌表達(dá)型質(zhì)粒上，均含有 與啟動(dòng)子來(lái)源相同的核糖體結(jié)合位點(diǎn)序列，序列和間隔是最佳的。 20221022 23 目的基因在宿主中的表達(dá) ?起始密碼子及其后續(xù)若干密碼子的影響： 大腸桿菌中的起始 tRNA分子可以同時(shí)識(shí)別 AUG、 GUG和 UUG 三種起始密碼子，但其識(shí)別頻率并不相同，通常 GUG為 AUG的 50% 而 UUG只及 AUG的 25%。 20221022 22 目的基因在宿主中的表達(dá) ?SD序列與起始密碼子之間的距離的影響： SD序列與起始密碼子之間的精確距離保證了 mRNA在核糖體 上定位后，翻譯起始密碼子 AUG正好處于核糖體復(fù)合物結(jié)構(gòu)中的 P 位，這是翻譯啟動(dòng)的前提條件。 20221022 21 目的基因在宿主中的表達(dá) ?SD序列與起始密碼子之間的序列的影響： SD序列下游的堿基若為 AAAA或 UUUU，翻譯效率最高； 而 CCCC或 GGGG的翻譯效率則分別是最高值的 50%和 25%。 ③ SD序列與翻譯起始密碼子之間的距離及堿基組成 ④ 基因編碼區(qū) 5’ 端若干密碼子的堿基序列 20221022 20 目的基因在宿主中的表達(dá) (2)核糖體結(jié)合位點(diǎn)對(duì)外源基因表達(dá)的影響 ?SD序列的影響： 一般來(lái)說(shuō)， mRNA與核糖體的結(jié)合程度越強(qiáng)，翻譯的起始效 率就越高，而這種結(jié)合程度主要取決于 SD序列與 16S rRNA的堿 基互補(bǔ)性， 其中以 GGAG四個(gè)堿基序列尤為重要。 mRNA翻譯的起始效率主要由其 5’ 端 的結(jié)構(gòu)序列所決定，稱為核糖體結(jié)合位點(diǎn)（ RBS， Ribosome Binding Site） 20221022 19 目的基因在宿主中的表達(dá) (1)核糖體結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)構(gòu) 大腸桿菌核糖體結(jié)合位點(diǎn)包括下列四個(gè)特征結(jié)構(gòu)要素： ① 位于翻譯起始密碼子上游的 68個(gè)核苷酸序列 5’ UAAGGAGG 3’： 即 ShineDalgarno（ SD）序列，它通過(guò)識(shí)別大腸桿菌核糖體小亞基中 的 16S rRNA 3’端區(qū)域 3’ AUUCCUCC 5’并與之專(zhuān)一性結(jié)合，將 mRNA定位于核糖體上，從而啟動(dòng)翻譯。 核糖體結(jié)合位點(diǎn) RBS 外源基因在大腸桿菌細(xì)胞中的高效表達(dá)不僅取決于轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)的 頻率，而且在很大程度上還與 mRNA的翻譯起始效率密切相關(guān)。對(duì) 于一些終止作用較弱的終止子，通常可以采用二聚體終 止子串聯(lián)的特殊結(jié)構(gòu)，以增強(qiáng)其轉(zhuǎn)錄終止作用。 在正常的細(xì)菌培養(yǎng)體系中，除去 色氨酸是困難的，因此基因工程 中往往添加 IAA誘導(dǎo) Ptrp介導(dǎo)的目 基因的表達(dá)。 ?cAMP的正調(diào)控作用 20221022 16 目的基因在宿主中的表達(dá) (3)啟動(dòng)子的可控性： 色氨酸啟動(dòng)子 Ptrp的可控性 色氨酸啟動(dòng)子 Ptrp受色氨酸 阻遏 蛋白復(fù)合物的阻遏，轉(zhuǎn)錄呈基底 狀態(tài)。葡萄糖代謝使 cAMP減少，從而阻遏 Plac介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄。 20221022 8 目的基因在宿主中的表達(dá) 一、 外源基因在大腸桿菌中的表達(dá) 20221022 9 目的基因在宿主中的表達(dá) ?全基因組測(cè)序，共有 4405個(gè)開(kāi)放閱讀框 ?基因克隆表達(dá)系統(tǒng)成熟完善 ?繁殖迅速、培養(yǎng)簡(jiǎn)單、操作方便、遺傳穩(wěn)定 ?被美國(guó) FDA批準(zhǔn)為安全的基因工程受體生物 20221022 10 目的基因在宿主中的表達(dá) ?缺乏對(duì)真核生物蛋白質(zhì)的復(fù)性功能 ?缺乏對(duì)真核生物蛋白質(zhì)的修飾加工系統(tǒng) ?內(nèi)源性蛋白酶降解空間構(gòu)象不正確的異源蛋白 ?細(xì)胞周質(zhì)內(nèi)含有種類(lèi)繁多的內(nèi)毒素 20221022 11 目的基因在宿主中的表達(dá) ?啟動(dòng)子 ?終止子 ?核糖體結(jié)合位點(diǎn) ?密碼子 ?質(zhì)?？截悢?shù) 20221022 12 目的基因在宿主中的表達(dá) 啟動(dòng)子 目的基因 (1)啟動(dòng)子最佳距離的探測(cè) A E E 目的基因 E E A 酶切開(kāi) 啟動(dòng)子 Bal31酶解 20221022 13 目的基因在宿主中的表達(dá) PλL Ptrp (2)啟動(dòng)子的構(gòu)建 啟動(dòng)子 PrecA PtraA Plac Ptac 35 區(qū)序列 T T G A C A T T G A T A T A G A C A T T G A C A T T T A C A T T G A C A 10 區(qū)序列 G A T A C T T A T A A T T A A T G T T T A A C T T A T A A T T A T A A T Ptac = 3 Ptrp = 11 Plac 20221022 14 目的基因在宿主中的表達(dá) (3)啟動(dòng)子的可控性 ： 乳糖操縱子的啟動(dòng)子 Plac 野生型的 Plac與其控制區(qū) Olac 偶聯(lián)在一起，在沒(méi)有誘導(dǎo)物 存在時(shí)，整個(gè)操縱子處于基 底水平表達(dá)；誘導(dǎo)物可以使 啟動(dòng)子 Plac介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄大幅提 高。 ?更為嚴(yán)重的是，過(guò)長(zhǎng)的轉(zhuǎn)錄物往往不能形成理想的二級(jí)結(jié)構(gòu)，從而大大降低外源基因編碼產(chǎn)物的翻譯效率。 ?如果外源基因下游緊接有載體上的其它重要基因或 DNA功能區(qū)域，如選擇性標(biāo)記基因和復(fù)制子結(jié)構(gòu)等，則 RNA聚合酶在此處的轉(zhuǎn)錄可能干擾質(zhì)粒的復(fù)制及其它生物功能，甚至導(dǎo)致重組質(zhì)粒的不穩(wěn)定性。第七章 目的基因在宿主中的表達(dá) 20221022 1 目的基因在宿主中的表達(dá) ? 外源基因在大腸桿菌中的表達(dá) ? 外源基因在酵母菌中的表達(dá) ? 外源基因在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá) ? 外源基因在高等植物細(xì)胞中的表達(dá) 20221022 2 目的基因在宿主中的表達(dá) 緒：基因表達(dá)的關(guān)鍵因素 （關(guān)鍵和限速步驟） 轉(zhuǎn)錄 宿主 RNA聚合酶 啟動(dòng)子 20221022 3 目的基因在宿主中的表達(dá) ?非特異性終止 :衰減子 ,抗終止序列 ?正確終止轉(zhuǎn)錄： 終止序列 ?mRNA穩(wěn)定性與 Poly(A)尾有關(guān) ?載體上添加 Poly(A)摻入信號(hào) ?宿主 RNase缺失 ,增強(qiáng) mRNA穩(wěn)定性 20221022 4 目的基因在宿主中的表達(dá) 強(qiáng)化轉(zhuǎn)錄終止的必要性 外源基因在強(qiáng)啟動(dòng)子的控制下表達(dá)，容易發(fā)生轉(zhuǎn)錄過(guò)頭現(xiàn)象，即 RNA聚合酶滑 過(guò)終止子結(jié)構(gòu)繼續(xù)轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒上鄰近的 DNA序列，形成長(zhǎng)短不一的 mRNA混合物。 過(guò)長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄物的產(chǎn)生在很大程度上會(huì)影響外源基因的表達(dá)，其原因如下： ?轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物越長(zhǎng)， RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄一分子 mRNA所需的時(shí)間就相應(yīng)增加，外源基因本身的轉(zhuǎn)錄效率下降。 ?過(guò)長(zhǎng)的 mRNA往往會(huì)產(chǎn)生大量無(wú)用的蛋白質(zhì)，增加工程菌無(wú)謂的能量消耗。 20221022 5 目的基因在宿主中的表達(dá) 3． mRNA有效翻譯 原核翻譯 ⑴ AUG起始密碼子 ⑵ SD序列 :與 16SrRNA互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)，該序列至少含有 AGGAGG序列中的 4個(gè)堿基 ⑶ SD序列與 ATG之間合適距離 39bp ⑷翻譯起始區(qū)間內(nèi)不形成明顯二級(jí)結(jié)構(gòu) (5)終止密碼子： UAA 、 UAG、 UGA 20221022 6 目的基因在宿主中的表達(dá) 4．外源蛋白的穩(wěn)定性 融合蛋白 分泌蛋白表達(dá)系統(tǒng) 包涵體表達(dá)系統(tǒng) 使用蛋白水解酶基因缺陷型受體細(xì)胞 20221022 7 目的基因在宿主中的表達(dá) ? 1）位置效應(yīng) 目的基因位于甲基化程度高，轉(zhuǎn)錄活性低的異染色質(zhì)上 ? 2）轉(zhuǎn)錄水平基因沉默 啟動(dòng)子甲基化和外源基因的異染色質(zhì)化； 目的基因的重復(fù)序列可導(dǎo)致自身甲基化 ? 3）轉(zhuǎn)錄后水平基因沉默 共抑制 (cosuppression)是轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默，指被整合的外源基因沉默的同時(shí)，與其同源的內(nèi)源 DNA的表達(dá)也受到抑制。 ?誘導(dǎo)作用 20221022 15 目的基因在宿主中的表達(dá) (3)啟動(dòng)子的可控性： 乳糖操縱子的啟動(dòng)子 Plac 野生型的 Plac上游附近擁有代謝激活因子（ CAP）結(jié)合區(qū)，cAMP激活 CAP， cAMPCAP復(fù)合物與 DNA結(jié)合，改變DNA結(jié)構(gòu)，促進(jìn) RNA聚合酶和啟動(dòng)子結(jié)合，使轉(zhuǎn)錄能力增強(qiáng)。因此，基因工程中使用的乳糖啟動(dòng)子均為抗葡萄糖代謝阻遏的 突變型，即 Plac UV5。在培養(yǎng)系統(tǒng)中去除色氨酸 或者加入 3吲哚丙烯酸（ IAA）， 便可有效地解除阻遏抑制作用。 20221022 17 目的基因在宿主中的表達(dá) 終止子 20221022 18 目的基因在宿主中的表達(dá) 強(qiáng)終止子的選擇與使用 目前外源基因表達(dá)質(zhì)粒中常用的終止子是來(lái)自大腸桿菌 rRNA操縱子上的 rrnT1T2以及 T7噬菌體 DNA上的 Tφ。 終止子、啟動(dòng)子等，可以通過(guò)特殊的探針質(zhì)粒從細(xì)菌或 噬菌體基因組 DNA中克隆篩選。大 腸桿菌細(xì)胞中結(jié)構(gòu)不同的 mRNA分子具有不同的翻譯效率，它們之 間的差別有時(shí)可高達(dá)數(shù)百倍。 ② 翻譯起始密碼子： 大腸桿菌絕大部分基因以 AUG作為閱讀框架的起 始位點(diǎn)，但有些基因也使用 GUG或 UUG作為翻譯起始密碼子。 對(duì)多數(shù)基因而 言，上述四個(gè)堿基中任何一個(gè)換成 C或 T，均會(huì)導(dǎo)致翻譯效率大幅 度降低。緊鄰 AUG的前三個(gè)堿基成份對(duì)翻譯起始也有影響，對(duì)于大腸桿菌 β半 乳糖苷酶的 mRNA而言，在這個(gè)位置上最佳的堿基組合是 UAU或 CUU，如果用 UUC、 UCA或 AGG取代之，則酶的表達(dá)水平低 20 倍。 在很多情況下， SD序列位于 AUG 之前大約七個(gè)堿基處， 在此間隔中少一個(gè)堿基或多一個(gè)堿基，均 會(huì)導(dǎo)致翻譯起始效率不同程度的降低。除此之外，從 AUG開(kāi)始的前幾個(gè)密碼子堿 基序列也至關(guān)重要，至少這一序列不能與 mRNA的 5’ 端非編碼區(qū)形 成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，否則便會(huì)嚴(yán)重干擾 mRNA在核糖體上的準(zhǔn)確定位。 20221022 24 目的基因在宿主中的表達(dá) 密碼子 （ 1）生物體對(duì)密碼子的偏愛(ài)性 不同的生物，甚至同種生物不同的蛋白質(zhì)編碼基因，對(duì)簡(jiǎn)并密碼 子使用頻率并不相同，具有一定的偏愛(ài)性，其決定因素是： ?密碼子與反密碼子相互作用的自由能： 性中等強(qiáng)度規(guī)律 如 GGG、 CCC、 GCG、 GGC、 AAA、 UUU、 AUA、 UAU等使用少； 如 GUG、 CAC、 UCG、 AGC、 ACA、 UGU、 AUC、 UUG等使用多； ?細(xì)胞內(nèi) tRNA的含量 ?生物基因組中的堿基含量： 在富含 AT的生物（如單鏈 DNA噬菌體 φX174）基因組中，密碼子第三位上的 U和 A出現(xiàn)的頻率較高；而在 GC豐富的生