目的基因的獲取ppt課件-wenkub
2023-01-30 05:38:27 本頁(yè)面
【正文】 AAAA3’ 3’ 5’ GSP 3’ 5’ 5’ 3’ ? 已知目的基因編碼的蛋白 N端部分氨基酸序列信息，可以以此設(shè)計(jì)特異引物，從總 RNA中獲得目的基因。 ?應(yīng)用范圍： 1）合成 PCR引物 2）寡核苷酸探針 3）人工接頭 4）較小的基因 固相亞磷酸三酯法 一、基本原理 二、支持物 可控微孔玻璃珠（ CPG） 三、單體 ? 3’位 二異丙基亞磷酸酰上的磷酸的羥基用甲基或 β 氰乙基保護(hù) ? 5’位 二甲氧基三苯甲基 （ DMT） OHGHH HHOCH2OD M TPOMeNCHMeMeCHMeMe四、反應(yīng)步驟 ? 第一步 核苷酸單體 1的去封閉（ Deblocking） 去除 CPG所連核苷上的 DMT，以暴露 5’羥基 ? 第二步 核苷酸單體 2的活化（ Activation） 形成亞磷酰胺四唑這種活性中間體 ? 第三步 連接（ Coupling） 亞磷酰胺四唑與 CPG所連的核苷酸縮合 ? 第四步 蓋帽（ Capping） 封閉未反應(yīng)的核苷酸單體 1 ? 第五步 氧化（ Oxidation） 三價(jià)磷氧化為五價(jià)的磷 ? 多次循環(huán)直到合成所需的長(zhǎng)度，用濃氨水將DNA從固相上洗脫下來(lái)，真空抽干，樣品溶于適量水中進(jìn)行純化分析。 pUC18/19是 —— 載體。 可以去除 DNA片段中突出的單鏈尾巴。 寄主控制的限制與修飾現(xiàn)象涉及到的兩種酶是 和 。 pUC11 119是 —— 載體。 化學(xué)合成的單元操作 OHGHH HHOCH2OD M TPOMeNCHMeMeCHMeMeO H G H H H H O CH 2 O DMT P O Me N CH Me Me CH Me Me H DMT： 二甲氧基三苯甲基 激活 縮合 氧化 脫取代基 可控微孔玻璃珠 CPG 連接臂 五、基因的組裝 目前合成能力 200b以內(nèi)，若要合成更長(zhǎng)的基因，則需要先合成短的序列，然后再拼接到一起啊，稱為基因的組裝。 N端 C端 氨基酸序列： Val Phe Asn Ala Trp Lys Asp His 核苷酸序列 :GTNTT(T/C)AA(T/C)GCNTGGAA(A/G)GA(T/C)CA(T/C) 引物 1 引物 2 簡(jiǎn)并引物 1： GTNTT(T/C)AA(T/C)GCNTGGAA 共 16種 簡(jiǎn)并引物 2： GCNTGGAA(A/G)GA(T/C)CA 共 16種 反義引物： oligo（ dT） 1218 已知序列 mRNA 5’ AAAAAA3’ TTTTTTT5’(反義引物 ) 逆轉(zhuǎn)錄 mRNA 5’ AAAAAA3’
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