目的基因的獲取ppt課件(參考版)
2025-01-18 05:38本頁(yè)面
【正文】 思考題： 試述構(gòu)建基因文庫(kù)的原理和步驟 ? 。 用 DNA重組技術(shù)將它們分開，即使在同一個(gè)寄主中表達(dá)，也不會(huì)直接發(fā)生相互作用不能激活相關(guān)的效應(yīng)基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。 基本原理： 許多真核生物的轉(zhuǎn)錄激活因子都是由兩個(gè)結(jié)構(gòu)上可以分開的、功能上相互獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域組成（ example）； 應(yīng)用重組 DNA技術(shù)，也可以將來自同一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子的、或者兩種不同轉(zhuǎn)錄因子的、分開的兩種結(jié)構(gòu)域，在體內(nèi)重新組裝成具有功能的轉(zhuǎn)錄因子，從而激活 UAS（上游激活序列）下游啟動(dòng)子調(diào)節(jié)的報(bào)告基因的表達(dá)。 第七節(jié) 酵母雙雜交系統(tǒng)分離目的基因 ?有效的分離能與已知的靶蛋白質(zhì)相互作用的蛋白質(zhì)的編碼基因。 mRNA: 5’N‘M’AAAAAA… AA3’(12種序列 ) 3’NMTTTTTTT… TT5’ 5’隨機(jī)引物 ： 10mer，更好的同第一鏈結(jié)合，從而呈現(xiàn)出更多種的 mRNA。T12MN通式表示。端錨定脫氧核苷酸引物，并用 539。 3 ’錨定引物： 12種不同的引物，用以反轉(zhuǎn)錄 mRNA，合成第一鏈 cDNA。是一種快速有效的克隆差異性表達(dá)基因的方法。 已知的分子標(biāo)記基因 350kb 未知的目的基因 ? 染色體步移的缺點(diǎn) 得不到重疊克隆而被打斷，前功盡棄 遇到重復(fù)序列而改變步移方向 二、染色體登陸（ chromosome landing） 構(gòu)建插入片段平均長(zhǎng)度大于目的基因與其緊密連鎖的分子標(biāo)記之間的距離的基因文庫(kù)，可以通過篩庫(kù)直接獲得含有目的基因的大克隆，從中分離目的基因，稱為染色體登陸。根據(jù)一些已知的與目的基因緊密連鎖的分子標(biāo)記可以獲得目的基因。 mDNA cDNA第一鏈的合成 5‘ ppp’5 G G AAAAAAAAAAAAAAOH 3’ 5‘ ppp’5 G G AAAAAAAAAAAAAAOH 3’ TTTTTTTTTTTTTTp 5’ 5‘ ppp’5 G G AAAAAAAAAAAAAAOH 3’ TTTTTTTTTTTTTTp 5’ cDNA第一鏈 引物 退火 逆轉(zhuǎn)錄酶 dNTPs 3） cDNA第二條鏈的合成 ?自身引物法 ?置換合成法 ?引導(dǎo)合成法 cDNA第二鏈的合成（ 自身引物法） 煮沸 NaOH AAAAAAAAAAAAAA 5‘ ppp’5 G G AAAAAAAAAAAAAAOH 3’ TTTTTTTTTTTTTTp 5’ TTTTTTTTTTTTTTp 5’ TTTTTTTTTTTTTTp 5’ AAAAAAAAAAAAAAOH 3’ TTTTTTTTTTTTTT OH 3’ Klenow dNTPs S1 cDNA第二鏈的合成（置換合成法） DNApol dNTPs RNaesH 5‘ ppp’5 G G AAAAAAAAAAAAAAOH 3’ TTTTTTTTTTTTTTp 5’ AAAAAAAAAAAAAAp 5’ 5’ S1 AAAATTTOH 3’ TTTTTTTTTTTTTTp 5’ 5’ TTTTTTTTTTTTTTOH 3’ AAAAAAAAAAAAAA 5’ 5’ TTTTTTTTTTTTTT 3’ 3’ T4DNA ligase 4） cDNA與載體連接和導(dǎo)入宿主細(xì)胞 三、篩選基因文庫(kù)獲取目的基因 從基因文庫(kù)中篩選目的基因 密集鋪板（ 110萬） 雜交 挖取 鋪板 鋪板 目的重組克隆 第四節(jié) 轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽法獲得目的基因 基本原理 ?轉(zhuǎn)座子插入某一基因或其關(guān)鍵調(diào)控基因內(nèi)部會(huì)造成隱性性狀表達(dá)或產(chǎn)生突變，據(jù)此獲得含有轉(zhuǎn)座子的純合體并構(gòu)建基因組文庫(kù)，以轉(zhuǎn)座子特異基因?yàn)樘结樅Y選陽(yáng)性克隆，從中得到轉(zhuǎn)座子兩側(cè)序列，以之為探針篩選正常的基因組文庫(kù)獲得目的基因。 ： ? 長(zhǎng)度小 , 操作方便； ? 便于篩選
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