【正文】 l 20mM dATP 和 的Taq 酶， 72℃ 保溫 10min ，然后進行直接進行 TA克隆。 方案二 PCR 反應(yīng)（ 50181。l 10 Taq DNA Polymerase Buffer、 4種dNTP或 dATP（終濃度為 200nM）、 Taq DNA Polymerase，加水至終反應(yīng)體積為 50181。由于該突出堿基的存在，克隆時可以使用 T載體克隆目的基因 2022/5/26 PCR法獲取目的基因 72 ? 具有 3‘5’ 外切酶活性的 DNA 聚合酶（如 pfu聚合酶），其擴增的 PCR 產(chǎn)物是平末端 , 要對這種平末端的 PCR 產(chǎn)物進行克隆 , 應(yīng)首先對 PCR產(chǎn)物的 3‘末端進行加 A的工作。 2022/5/26 55 PCR法獲取目的基因 （ 3） 操作步驟 ① 細胞或組織固定：細胞經(jīng)固定和乙醇通透化處理后使得一般 PCR試劑 （ 包括引物和 Taq酶 ） 能夠進入細胞 ② PCR擴增細胞內(nèi)目的片段 ③ 原位雜交檢測擴增產(chǎn)物 mRNA表達 2022/5/26 56 PCR法獲取目的基因 PCR（ RTPCR) 逆轉(zhuǎn)錄酶 DNA聚合酶 mRNA cDNA 雜合雙鏈 PCR擴增 2022/5/26 57 PCR法獲取目的基因 2022/5/26 PCR法獲取目的基因 58 PCR（ realtime PCR) 通過熒光染料或熒光標記的特異性探針，對 PCR產(chǎn)物進行標記跟蹤，實時在線監(jiān)控反應(yīng)過程，結(jié)合相應(yīng)的軟件可以對結(jié)果進行分析，計算待測樣品的初始模板量。 ISPCR則可把這兩者結(jié)合起來，成為細胞學(xué)診斷中一種嶄新的檢測技術(shù)。 2022/5/26 54 PCR法獲取目的基因 （ 2） 原位 PCR的作用 鑒定細胞內(nèi)特異序列一般采用原位雜交（ ISH），但在每個細胞中目的片段的拷貝數(shù)少于 10的情況下，該方法的敏感度就明顯下降。它是利用完整的細胞作為一個微小的反應(yīng)體系來擴增細胞內(nèi)的目的片段，在不破壞細胞的前提下，利用一些特定的檢測手段來檢測細胞內(nèi)的擴增產(chǎn)物。 用途 ：特別適合大量臨床標本的基因診斷； 可同時檢測多種基因成分。 已知序列 未知序列 未知序列 2022/5/26 47 PCR法獲取目的基因 PCR法獲取目的基因 PCR（復(fù)合 PCR） 目的 ：用于檢測特定基因序列的存在或缺失。 PCR (reverse PCR) 目的 ：是用反向的互補引物來擴增兩引物以外的 DNA片段，對某個已知 DNA片段兩側(cè)的未知序列進行擴增。常溫活性被封閉， 94— 95 ℃ 加熱幾分鐘后才激活其酶活性。 ? 進行反應(yīng)之前，先不加 Taq酶，等溫度上升到 72 ℃ 后再加入 Taq酶。因此，在進行 PCR反應(yīng)配制過程中，以及在熱循環(huán)剛開始，保溫溫度低于退火溫度時會產(chǎn)生非特異性產(chǎn)物。 2022/5/26 PCR法獲取目的基因 45 PCR(hot start PCR) ? 熱起動 PCR是除了設(shè)計好的引物之外，提高 PCR特異性最重要的方法之一。 ? 選擇初始復(fù)性溫度的原則：起始復(fù)性溫度應(yīng)該比引物的 Tm值高出 510度，然后每個循環(huán)遞減 12度。 用途 ： 制備核酸序列測定的模板 制備雜交探針 四、 PCR的類型 2022/5/26 42 PCR法獲取目的基因 高濃度引物 低濃度引物 2022/5/26 43 PCR法獲取目的基因 2022/5/26 PCR法獲取目的基因 44 PCR(touchdown PCR) ? 多循環(huán)的反應(yīng)程序使退火溫度越來越低。l) PCR 目的 ：擴增產(chǎn)生特異長度的單鏈 DNA。l PCR產(chǎn)物 ， 采用 ％ 瓊脂糖凝膠電泳分析 PCR產(chǎn)物的量 ， 檢測引物擴增的特異性 ， 并可根據(jù)標準脫氧核糖核酸的量粗略計算 PCR產(chǎn)物的總量 。l 2022/5/26 PCR法獲取目的基因 40 PCR條件： 94℃ 變性 5min后開始以下循環(huán) 94℃ 變性反應(yīng) 45 sec； 65℃ 退火反應(yīng) 45 sec； 72℃ 延伸反應(yīng) 1 min； 進行 30個循環(huán)； 最后 72℃ 反應(yīng) 7min； 4 ℃ 冷卻恒定 。l) 10 緩沖液（ Mg2+） : 5 181。l () Taq polymerase: 181。l (10mmol/L) P2: 1 181。l): 模板 : 1 181。 2022/5/26 PCR法獲取目的基因 36 ?PCR儀 、 臺式離心機 、 滅菌的微量離心管 、 凝膠電泳系統(tǒng)等 ?TaKaRa Taq (5U/181。開管動作要輕，以防管內(nèi)液體濺出。 2022/5/26 PCR法獲取目的基因 34 ? 減少 PCR循環(huán)次數(shù)， 只要 PCR產(chǎn)物達到檢測水平就適可而止。 ? 防止操作人員污染，使用一次性手套、吸頭，小離心管應(yīng)一次性使用。以減少重復(fù)加樣次數(shù)，避免污染機會。吸樣要慢，吸樣時盡量一次性完成，忌多次抽吸，以免交叉污染或產(chǎn)生氣溶膠污染。 ? 吸樣槍 :吸樣槍污染是一個值得注意的問題。④ PCR產(chǎn)物鑒定區(qū)。② PCR反應(yīng)液制備區(qū) 。 2022/5/26 PCR法獲取目的基因 32 ? 合理分隔實驗室 :將樣品的處理、配制 PCR反應(yīng)液、PCR循環(huán)擴增及 PCR產(chǎn)物的鑒定等步驟分區(qū)或分室進行，特別注意樣本處理及 PCR產(chǎn)物的鑒定應(yīng)與其它步驟嚴格分開。 2022/5/26 PCR法獲取目的基因 31 ? 陰性對照 :每次 PCR實驗務(wù)必做陰性對照。 但陽性對照尤其是重組質(zhì)粒及高濃度陽性標本，對檢測或擴增樣品污染的可能性很大。 2022/5/26 PCR法獲取目的基因 30 ? 陽性對照 :在建立 PCR反應(yīng)實驗室及一般的檢驗單位都應(yīng)設(shè)有 PCR陽性對照，它是 PCR反應(yīng)是否成功、產(chǎn)物條帶位置及大小是否合乎理論要求的一個重要的參考標志。 ? 試劑或樣品準備過程中都要使用一次性滅菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿應(yīng)洗滌干凈并高壓滅菌。 ? PCR試劑配制應(yīng)使用最高質(zhì)量的新鮮雙蒸水，采用 濾膜過濾除菌或高壓滅菌。 ? 所有試劑都應(yīng)該沒有核