cr技術(shù)簡(jiǎn)史ppt課件(參考版)
2025-01-11 00:23本頁(yè)面
【正文】 在檢測(cè)細(xì)胞的潛在感染方面也具有重要意義。 ISPCR則可把這兩者結(jié)合起來(lái)，成為細(xì)胞學(xué)診斷中一種嶄新的檢測(cè)技術(shù)。 適用于檢測(cè)病理切片中含量較少的靶序列 原位 PCR的作用 既往鑒定細(xì)胞內(nèi)特異序列一般采用原位雜交（ ISH），但在每個(gè)細(xì)胞中目的片段的拷貝數(shù)少于10的情況下，該方法的敏感度就明顯下降。 直接用細(xì)胞涂片或石蠟包埋組織切片在單個(gè)細(xì)胞中進(jìn)行ＰＣＲ擴(kuò)增。 特別適合大量臨床標(biāo)本的基因診斷 可同時(shí)檢測(cè)多種基因成分 病毒 1 病毒 2 病毒 3 病毒 4 標(biāo)記引物 ＰＣＲ 觀察 PCR產(chǎn)物 5）錨式 PCR 已知靶基因片段兩測(cè)的序列 VH CH1 CH1 CH2 CH2 CH3 CH3 VH VL VL CL CL cDNA 末端核酸轉(zhuǎn)移酶 3’GG…GG 5’ CC…CC 錨定引物 3’GG…GG 5’ CC…CC 3’GG…GG CC…CC 6） PCR固相分析法 模板 生物素化引物 PCR擴(kuò)增 探針 親和固相介質(zhì) 檢測(cè)探針信號(hào) 7）原位ＰＣＲ 原位聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（ In Still PCR， Is－PCR）是由 Haase等于 1990年首創(chuàng)。 已知序列 未知序列 未知序列 已知序列 未知序列 未知序列 限制酶 限制酶 連接酶 3）多重 PCR 用于檢測(cè)特定基因序列的存在或缺失。 用途：制備核酸序列測(cè)定的模板 制備雜交探針 基因組 DNA結(jié)構(gòu)功能的研究 高濃度引物 低濃度引物 2)反向 PCR (reverse PCR) 是用反向的互補(bǔ)引物來(lái)擴(kuò)增兩引物以外的 DNA片段對(duì)某個(gè)已知 DNA片段兩側(cè)的未知序列進(jìn)行擴(kuò)增。 方法：采用兩種不同濃度的引物。降低溫度可增加反應(yīng)的靈敏性。 2）循環(huán)參數(shù) (1)變性 使雙鏈 DNA解鏈為單鏈 95oC 2030秒 (2) 退火 溫度由引物長(zhǎng)度和 GC含量決定。 Mg2+濃度過(guò)低會(huì)使 Taq酶活性喪失、 PCR產(chǎn)量下降； Mg2+過(guò)高影響反應(yīng)特異性。 （ 5） Mg2+ Mg2+是 DNA聚合酶的激活劑。酶量過(guò)少影響反應(yīng)產(chǎn)量。 PCR反應(yīng)條件 （ 2）引物濃度 ?mol/L 濃度過(guò)高易導(dǎo)致模板與引物錯(cuò)配 ,反應(yīng)特異性下降。 一般 100ng DNA模板 /100?L。 3’ 5’ 3’ 5’ 限制性內(nèi)切酶的識(shí)別序列 啟動(dòng)子序列 定點(diǎn)突變 探針標(biāo)記 1） PCR反應(yīng)成分 （ 1）模板 單、雙鏈 DNA均可。 （ 5）兩引物間避免有互補(bǔ)序列。 （ 3） 堿基盡可能隨機(jī)分布 ， G+C占 5060%。 生物樣品 DNA片段 基因診斷 基因治療 基因
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