cr技術(shù)及應(yīng)用jyhppt課件(參考版)
2025-05-08 12:06本頁(yè)面
【正文】 Realtime（實(shí)時(shí)熒光定量） PCR ——TaqMan探針?lè)? 擴(kuò)增曲線(xiàn)分析 設(shè)置：基線(xiàn)和閾值線(xiàn) 擴(kuò)增曲線(xiàn)分析 基線(xiàn)： 315循環(huán) 基線(xiàn)： 13循環(huán) 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)： Ct值與 logC0成反比 七、 PCR技術(shù)在臨床檢驗(yàn)中的應(yīng)用 在常見(jiàn)病原體檢測(cè)中的應(yīng)用： HBVDNA、 HCVRNA、 EBDNA、 HCMVDNA、 MPDNA、 UUDNA、 CTDNA、 HSV2DNA、 NGDNA 分子遺傳學(xué)研究：基因變異、表達(dá)、重組、進(jìn)化等 醫(yī)學(xué)診斷：遺傳病、基因病、癌變、代謝性遺傳病等 法醫(yī)學(xué)鑒定 組織器官移植配型： HLASSP配型 。 檢測(cè)方法： Ⅰ 法 : 在 PCR反應(yīng)體系中，加入過(guò)量 SYBR熒光染料， SYBR熒光染料特異性地?fù)饺? DNA雙鏈后，發(fā)射熒光信號(hào)，而不摻入鏈中的 SYBR染料分子不會(huì)發(fā)射任何熒光 信號(hào)，從而保證熒光信號(hào)的增加與 PCR產(chǎn)物的增加完全同步。 引物 3′末端堿基在錯(cuò)誤配對(duì)時(shí)不同堿基的引發(fā)效率存在很大差異，最好選 T、 G、 C，而不選 A。最多可游離 10個(gè)堿基并不影響 PCR反應(yīng)進(jìn)行。要求在引物設(shè)計(jì)時(shí)采用計(jì)算機(jī)進(jìn)行輔助檢索分析。 ⑶ 引物內(nèi)部不能含有自身互補(bǔ)序列，否則會(huì)形成發(fā)夾樣二級(jí)結(jié)構(gòu)，兩個(gè)引物之間尤其在 3’ 末端不應(yīng)有互補(bǔ)鏈存在，不然會(huì)形成引物二聚體。 引物設(shè)計(jì)原則 ⑴ 長(zhǎng)度 15～ 30 b，過(guò)短特異性降低，過(guò)長(zhǎng)則成本增加，產(chǎn)量也下降。 循環(huán)次數(shù)越多，非特異擴(kuò)增增加。 四、 PCR反應(yīng)條件優(yōu)化： ⑷ 循環(huán)數(shù)： 其他參數(shù)選定后， PCR循環(huán)次數(shù)主要取決于模板 DNA的濃度。 延伸反應(yīng)時(shí)間，可根據(jù)待擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度而定， 1Kb， 1分鐘足夠； 1Kb需加長(zhǎng)延伸時(shí)間， 10Kb片段延伸時(shí)間可達(dá) 15分鐘。 四、 PCR反應(yīng)條件優(yōu)化： ⑶ 延伸溫度和時(shí)間： 一般位于 Taq酶最適作用溫度 70 ～ 75 ℃ 之間。復(fù)性溫度越低，產(chǎn)物特異性越低。
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