cr擴增產(chǎn)物的分析ppt課件(參考版)
2025-05-08 12:06本頁面
【正文】 此時，擴增產(chǎn)物無論大小，只要均被擴增，就可見一條紅綠互補的黃色條帶 顏色互補分析法 ——方法學(xué)評價 ? 該法簡便、易于自動化 ? 可用于檢測基因（缺失、染色體轉(zhuǎn)位）和病原微生物 –只判斷產(chǎn)物的有無 –在檢測多種基因?qū)嵶儭⒍喾N病原菌和HLA分型時，可用復(fù)合 PCR。 ? 鹽濃度合適時， DNA應(yīng)為一端固定到微孔板上，而太低或太高濃度的鹽可能使 DNA “平躺”固定在孔內(nèi)而影響雜交 DNA的固定 ? Mg2+雖有促進 DNA固定的作用，但它可激活 Dnase，所以，一般不用 ? 被固定的 DNA應(yīng)大于 300bp，否則影響雜交結(jié)果。顯色后，判斷合適的固定鹽濃度 DNA的固定 ? 固定方法的選擇必須使 DNA最大量的固定，且不影響雜交 ? 用合適濃度的 NaCl 或（ NH4） 2SO4 可達到此目的。 斑點雜交： ? 將 PCR 產(chǎn)物點在硝酸纖維素膜或尼龍膜薄膜上 ? 寡核苷酸探針雜交 ? 觀察有無著色斑點 ? 主要用于 PCR產(chǎn)物特異性鑒定及變異分析 RDB檢測 ?地中海貧血突變基因 29（ A?G） 28（ A?G） 17（ A?T， AAG ? TAG） βE （ CD26 GAG ? AAG） IVSI1（ G?T ） IVSI5（ G?C） 2728（ +C） 4142（ CTTT） 43（ G?T ） 7172（ +A或 +T） 654（ C?T） 微孔板夾心雜交法 ? 通過一固定于微孔板的捕獲探針與 PCR產(chǎn)物的某一區(qū)域特異性雜交，使 PCR產(chǎn)物間接地固定于微孔板上，然后，再用一生物素等非放射性標記物標記的檢測探針與產(chǎn)物的另一區(qū)域特異性雜交，漂洗后顯色即可判斷結(jié)果 ? 該法使用了兩個雜交過程來檢測一個產(chǎn)物，其特異性較一次雜交的檢測法高 Principle ： NOS（ 1 1014/cm2） N羥化琥珀酰亞胺酯 Principle CCCCCC Capture Probe: ： NH2 Detection Probe: ： Biotin Principle ： NH2標記的探針 ： Biotin標記的探針 AvidinHRP 顯色系統(tǒng) ： NOS基團 Principle 微孔板夾心雜交法 ——方法學(xué)評價 ? 敏感度：該法檢測 HBV，敏感度達 5個 HBV DNA分子 ? 敏感性和特異性與 PCR 32P 探針的 Southern雜交法相當(dāng) ? PCR微孔板夾心雜交法：操作簡便、快速、避免了同位素標記探針的危害，顯色反應(yīng)類似于臨床常規(guī)應(yīng)用的 ELISA 微孔板直接雜交 ? 不是采用夾心法，而是直接將特異的探針固定于微孔板上，然后用生物素標記的 PCR產(chǎn)物與之雜交 ? 只進行一次雜交，方法簡單，但特異性不高 微孔板雜交的基本過程 ? DNA的固定 ? 探針的雜交 ? 酶
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