cr的種類及應用ppt課件(參考版)
2025-01-11 00:23本頁面
【正文】 這種方法可用于省去多次試驗最佳黏合溫度的工作。在剛下降到特異性結(jié)合可以進行的最高溫度時，可以達到最高的特異性。因此進行 PCR時需要尋找合適的黏合溫度。如：病毒，梅毒螺旋體， HIV，腫瘤基因等 巢式 PCR，可以在 106基因組背景下檢測到一個拷貝的病毒基因，所以特異性很好，但也是最容易污染的 PCR。因此，巢式 PCR的擴增非常特異 。第二對引物稱為巢式引物（因為他們在第一次 PCR擴增片段的內(nèi)部）結(jié)合在第一次 PCR產(chǎn)物內(nèi)部，使得第二次 PCR擴增片斷短于第一次擴增。 2022/2/3 24 巢式 PCR 巢式 PCR是一種變異的聚合酶鏈反應 (PCR)，使用兩對（而非一對） PCR引物擴增完整的片段。 用 TaqMan探針 進行多重實驗擴增分析基因表達差異 （ 3）基因型 /等位基因分析，例如 SNP檢測等 （ 4）轉(zhuǎn)基因生物檢測 ，比如可以準確的檢測食品中某一種轉(zhuǎn)基因成分的含量。 （ 2）基因表達差異分析。 QPCR的應用 （ 1）熒光定量 PCR數(shù)據(jù)分析，絕對定量和相對定量。 缺點：探針的初始成本比較高和實驗設計比較繁瑣。 缺乏特異性；不能用于多重反應，因為不能區(qū)分不同擴增子發(fā)出的熒光，用于單重實驗 。作標準曲線用來評定反應條件的優(yōu)化（保證樣本有準確可重復的實驗結(jié)果） QPCR 熒光化學方法 1） DNA結(jié)合燃料（ SYBR Green 1） SYBR Green 1 是熒光定量 PCR最常用的 DNA結(jié)合燃料，與 dsDNA非特異性結(jié)合。利用熒光信號的變化實時檢測 PCR擴增反應中每一個循環(huán)擴增產(chǎn)物量的變化 ,通過 Ct值和標準曲線的分析對起始模板進行定量分析 將模板稀釋成一系列的濃度梯度進行PCR反應，用個這個結(jié)果作標準曲線，模板可以用已知濃度的樣品或未知濃度的樣品。單純皰疹病毒的分型 。 1）多種病原微生物的同時檢測或鑒定，是在同一 PCR反應管中同時加上多種病原微生物的特異性引物，進行 PCR擴增 . 2）某些病原微生物，某些遺傳病或癌基因，型別較多，或突變或缺失存在多個好發(fā)部位，多重 PCR可提高其檢出率并同時鑒定其型別及突變等可系統(tǒng)應用的有 :乙型肝炎病毒的分型 。 4. 電泳檢測及結(jié)果分析：取擴增產(chǎn)物 10 與 26 載樣緩沖液 (溴酚藍 )混勻上樣，同時加入分子量標準，經(jīng) 2％瓊脂糖凝膠 (含 、恒壓 (200600V)、電泳 12小時后，置凝膠于紫外檢測凝膠分析儀觀察結(jié)果，并拍照，記錄分析結(jié)果。這是因為，多重 PCR技術是在擴增體系中加入了多對引物同時進行擴增，這樣就會由于錯配而產(chǎn)生一些非特異性的擴增產(chǎn)物，增高退火溫度，可以有效的減少非特異性擴增產(chǎn)物的生成；二是循環(huán)參數(shù)要盡量少，以利于檢測擴增產(chǎn)物。根據(jù)實驗要求，設計合適的循環(huán)參數(shù)。 2. DNA定量：用紫外分光光度計進行 DNA含量測定。 2022/2/3 15 不對稱 PCR的原理 多重 PCR 一般 PCR僅應用一對引物，通過 PCR擴增產(chǎn)生一個核酸片段，主要用于單一致病因子等的鑒定 .多重 PCR(multiplex PCR)，又稱多重引物 PCR或復合 PCR，它是在同一 PCR反應體系里加上二對以上引物，同時擴增出多個核酸片段的 PCR反應，其反應原理，反應試劑和操作過程與一般 PCR相同 多重 PCR的試驗
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