cr質(zhì)控及問題分析ppt課件(參考版)
2025-05-08 12:06本頁面
【正文】 臨床 PCR檢測的常見問題 假陽性問題 假陰性問題 定量問題 ? 方法學(xué)問題：靶基因序列特異性、非特異性擴(kuò)增尤其引物 二聚體 PD擴(kuò)增 ? 污染問題：樣本污染、產(chǎn)物污染 ? 試劑因素 ? 操作因素 ? 儀器因素 ? 標(biāo)本因素 ? 外標(biāo)定量與內(nèi)標(biāo)定量 干擾物質(zhì)： 人白蛋白 膽紅素 游離血紅蛋白 類風(fēng)濕因子 總 IgG 甘油三酯 。 熒光定量 PCR常見問題 擴(kuò)增效率低： 重復(fù)性不好： ? 反應(yīng)體系中部分成分尤其是熒光染料降解； ? 反應(yīng)條件不佳：延長退火、延伸時間，改為三步法， 降低退火溫度，提高引物濃度，重新設(shè)計引物； ? 反應(yīng)體系中有抑制物：一般為模板引入。 ?擴(kuò)增片段過長： 100~200bp。 熒光定量 PCR常見問題 無 Ct值（信號）出現(xiàn) 或出現(xiàn)過晚： 陰性對照出現(xiàn) 明顯的擴(kuò)增： ?熒光 PCR mix或水污染； ?出現(xiàn)引物二聚體：設(shè)計特異性引物。HANDS ,Nucleic Acids Res.,1997,(16): 3215～ 3241］ 采用 artificial homo引物完全消除 PD非特異性 ,但顯著降低特異性擴(kuò)增效率。 常規(guī)終末 PCR問題 : 同一樣本重復(fù)復(fù) 48管反應(yīng) PCR終末檢測或平臺期檢測變化非常大 ,無法精確定量 (左圖 )。 ?增強(qiáng)劑濃度要適當(dāng)。 策略之四使用 PCR增強(qiáng)劑 ? 甲酰胺、 DMSO、 TMA、 甜菜堿等都可充當(dāng) PCR的增強(qiáng)劑。 ?遞減 PCR對于那些不了解引物和目的模板同源性程度的方法更為有用，如 AFLP、 DNA指紋分析等。循環(huán)設(shè)在比估算的Tm高大約 5℃ 的退火溫度下開始，然后每個循環(huán)降低 12℃ ,直到退火溫度低于 Tm 5℃ 。 RACE）的特異性。 提高 PCR反應(yīng)特異性策略 ? 巢
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