cr技術(shù)及注意事項(xiàng)ppt課件(參考版)
2025-05-08 12:06本頁(yè)面
【正文】 參比染料設(shè)定不正確 (MasterMix不加參比染料時(shí)，選 NONE) 模板的濃度太高或者降解 熒光染料的降解 QPCR常見問題分析 ? Thank you！ 。 QPCR常見問題分析 7. 擴(kuò)增曲線的異常。 反應(yīng)條件不夠優(yōu)化：可適當(dāng)降低退火溫度或改為三步擴(kuò)增法。 模板有基因組的污染： RNA提取過程中避免基因組 DNA的引入，或通過引物設(shè)計(jì)避免非特異擴(kuò)增。 引物濃度不佳：適當(dāng)降低引物的濃度，并注意上下游引物的濃度配比。 模板有基因組的污染： RNA提取過程中避免基因組 DNA的引入，或通過引物設(shè)計(jì)避免非特異擴(kuò)增。 引物濃度不佳：適當(dāng)降低引物的濃度，并注意上下游引物的濃度配比。 模板中存在抑制物，或模板濃度過高。 標(biāo)準(zhǔn)品出現(xiàn)降解 : 應(yīng)避免標(biāo)準(zhǔn)品反復(fù)凍融，或重新制備并稀釋標(biāo)準(zhǔn)品。 PCR產(chǎn)物太長(zhǎng) : 一般采用 80150bp的產(chǎn)物長(zhǎng)度。設(shè)計(jì)更好的引物或探針；改用三步法進(jìn)行反應(yīng)；適當(dāng)降低退火溫度；增加鎂離子濃度等。 模板降解 : 避免樣品制備中雜質(zhì)的引入及反復(fù)凍融的情況。 引物或探針降解 : 可通過 PAGE電泳檢測(cè)其完整性。 ? 溶解曲線分析可以用來確定不同的反應(yīng)產(chǎn)物，包括非特異性產(chǎn)物。 Green ? 從實(shí)驗(yàn)成本來講， Sybr Green是最好的，基本上就是普通 PCR加上 Sybr Green I熒光染料即可，其信號(hào)強(qiáng)度也很好，還可以進(jìn)行融解曲線分析等，但缺點(diǎn)是只能在一個(gè)反應(yīng)管內(nèi)進(jìn)行一種 PCR反應(yīng)的檢測(cè)，另一個(gè)問題是非特異性擴(kuò)增會(huì)影響實(shí)驗(yàn) 結(jié)果，當(dāng)然也有一些技術(shù)解決這些問題。 Green是一種結(jié)合于小溝中的雙鏈 DNA結(jié)合染料，與雙鏈 DNA結(jié)合后，其熒光大大增強(qiáng)。 Beacon 技術(shù) ： ? 上兩種方法特異性強(qiáng)，但是成本較高，探針設(shè)計(jì)要求較高。 Taqman 技術(shù) ： ? TaqMan引物、探針設(shè)計(jì)： 首先選擇探針序列 探針的 Tm值為 68－ 70度，長(zhǎng)度不應(yīng)超過 30堿基 探針的 5’端不應(yīng)是 G， G有可能會(huì)淬滅熒光素 引物應(yīng)盡量靠近探針，擴(kuò)增片斷不超過 400bp，通常為 80－ 150bp 引物的 Tm值為 59－ 60度，長(zhǎng)度約 20堿基 避免引物、探針之間的二級(jí)結(jié)構(gòu) ? 該技術(shù)以美國(guó)人 Tagyi 為代表。 － 339。 PCR 擴(kuò)增時(shí)，在加入一對(duì)引物的同時(shí)加入一個(gè)特異性的熒光探針。 ? 擴(kuò)增曲線：在 PCR過程中，以循環(huán)數(shù)為橫坐標(biāo)，實(shí)時(shí)熒光信號(hào)強(qiáng)度為縱坐標(biāo)
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