cr操作規(guī)范ppt課件(參考版)
2025-01-13 08:36本頁面
【正文】 。 ) 加入試劑 B（ 氯仿 、 異戊醇 ） 50μl混勻 （ 抽取變性劑及變性的蛋白 ， 分離出核酸 ， 同樣必須充分 混勻 ， 否則也會(huì)引起 PCR檢測失敗 ) 14 000r/min離心 5min取上清 80～ 100μl ( 取上清一定要 小心 ， 不能抽取中間蛋白沉淀層 ， 否則 因核酸沉淀中含有變性蛋白 ， 引起 PCR檢測失敗 ) 加等體積試劑 C14 000r/min離心 10min， 棄上清 (將核酸從水溶液中沉淀濃縮 ) 用 75%乙醇洗一次 (除去與核酸共沉淀的鹽及雜質(zhì) ) 干燥備用 (干燥后 ， 切勿將管子 倒置 或掉落 ， 防止沉淀飛出管底 ) 在痰標(biāo)本處理時(shí)液化是十分重要的 ，痰沒有徹底液化 ， 病原體不能完全釋放出來；反之液化過度會(huì)使病原體裂解 ，導(dǎo)致 PCR檢測失敗 。 如 HCV RNA PCR樣品處理試劑 A、B、 C和 75%乙醇的操作過程。 ⑥實(shí)驗(yàn)室污染 3. PCR檢測結(jié)果不穩(wěn)定 （ 1） 樣品處理方法不當(dāng) ， 標(biāo)本中雜質(zhì)很多 ， 血清標(biāo)本有蛋白質(zhì) 、 血紅素 、 代謝產(chǎn)物等 。 ③ 打開標(biāo)本管蓋引起樣品飛濺 （ 打開前須瞬間離心 ） ④操作時(shí)手套引起的交叉污染 （拿過模板 DNA管后應(yīng)更換手套） ⑤ 不明原因引起公用試劑如液體石蠟等污染 （ 必須設(shè)置一個(gè)不含模板 DNA但含 PCR系統(tǒng)中所有其他成分的對照反應(yīng) 。 常見的原 因有以下 6點(diǎn)： ① 加入試劑或樣品時(shí)引起的交叉污染 （最好在加完所有其他反應(yīng)成分，包括防止蒸發(fā)用的礦物油后才吸加 模板DNA， 將模板加入微量離心管后，蓋好離心管并用戴有手套的手指輕輕單擊管側(cè)壁，以搖勻液體，再作瞬時(shí)離心 [10秒 ]，使水相和有機(jī)相分開）。 (2) 標(biāo)本保存不當(dāng) ， 可引起 PCR失敗 。 實(shí)驗(yàn)室操作垃圾（ 吸頭、離心管、樣品杯 等 ）亂 放， 飄散在空氣中的核酸片段、病原微生物可造成實(shí)驗(yàn)室 污染。 PCR結(jié)果檢測實(shí)驗(yàn)室和其它實(shí)驗(yàn)室在一 起 ， 會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重的擴(kuò)增子污染 。 離心機(jī)： ①離心前，離心管須配平； ②將調(diào)速檔打至 0檔位，才能打開電源開關(guān)，逐漸升高轉(zhuǎn)速，直至即定轉(zhuǎn)速； ③定時(shí)旋鈕不能強(qiáng)行歸零； ④轉(zhuǎn)頭未停止時(shí)，嚴(yán)禁打開蓋板。 PCR熱循環(huán)儀的差異或質(zhì)量問題 。 RNA PCR樣品處理時(shí) ， 血清 （ 或血漿 ） 中加入強(qiáng) 烈變性劑后 ， 血樣中的蛋白變性 、 結(jié)塊 。 四 、 因操作欠規(guī)范導(dǎo)致的問題分析 （一）實(shí)驗(yàn)室儀器設(shè)備 設(shè)備不齊全 、 不配套 ， 使得實(shí)驗(yàn)結(jié)果不穩(wěn)定 ， 引起假性結(jié)果 。 T A T A T A T A T A PCR A U A
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