第二章基因工程制藥part2(編輯修改稿)
2025-11-19 22:08 本頁面
【文章內容簡介】 確與否產生影響。 采用較弱的啟動子或部分誘導強啟動子的方法可降低蛋白質合成的速率，從而達到增加正確折疊重組蛋白質的目的。,?,大腸桿菌表達系統(tǒng)研究的發(fā)展趨勢,改造信號肽的序列和結構，提高分泌效率,比較成功的例子是發(fā)現(xiàn)了把堿性磷酸酯酶基因phoA信 號肽的疏水區(qū)置換為多聚Leu殘基能明顯提高分泌效率。表 明信號肽核心部位疏水性的增強有利于它與細胞膜的相互作用。這一結果為天然信號肽優(yōu)化改造的設計提供了很好參考依據。,?,大腸桿菌表達系統(tǒng)研究的發(fā)展趨勢,大腸桿菌表面表達技術的建立,膜蛋白基因在大腸桿菌中表達的技術逐漸成為研究的熱點 領域，膜蛋白表達技術的發(fā)展促進了大腸桿菌表面技術的 建立。 外源蛋白質在菌體表面表達的優(yōu)點是大腸桿菌可直接用于 制備疫苗，進行生物催化和作為探針篩選藥物。在一定程 度上能與噬菌體展示系統(tǒng)相媲美。,?,大腸桿菌表達系統(tǒng)研究的發(fā)展趨勢,大腸桿菌表面表達技術的建立,主要通過三條途徑是目標蛋白呈現(xiàn)在菌體表面： 把外源序列插入LamB、OmpA、PhoE等外膜蛋白的膜外區(qū) 把外源蛋白導入大腸桿菌鞭毛或傘毛的結構 這二種方法適合表達一段長度小于100個氨基酸殘基的外源序列，因為較大的外源序列的插入往往會使外膜蛋白不能形成原來的三維結構，影響它轉運過程和在膜上的定位。 在脂蛋白、lgA蛋白酶、ompA基因的N端或C端融合外源基因 這種融合表達的方法對外源基因的限制條件就比較小，其序列可在50到500氨基酸殘基長度范圍內。,?,大腸桿菌表達系統(tǒng)研究的發(fā)展趨勢,重組蛋白質修飾加工研究,蛋白質C末端酰胺化和側鏈糖基化是常見的翻譯后修飾加工類型，目前C末端酰胺化一般都是在體外通過肽酰苷氨酸酰胺酶把C末端甘氨酸轉換為氨基 把其他微生物的肽酰甘氨酸酰胺酶，真核生物糖基化過程所涉及的酶系導入大腸桿菌的設想很早就被提出，但這些工作都還在探索之中。其中需要研究的主要問題有： 如何使肽酰苷氨酸酰氨酶在大腸桿菌內有較高的活力和專一性； 如何通過基因工程技術改造真核生物的糖基化體系使其能整合到大腸桿菌的染色體中和對糖基化位置、糖基種類和長度進行控制。,?,重組工程菌的遺傳不穩(wěn)定性及其對策,基因工程菌遺傳不穩(wěn)定性的表現(xiàn)與機制 改善基因工程菌不穩(wěn)定性的策略,四、基因工程菌的穩(wěn)定性,?,重組工程菌的遺傳不穩(wěn)定性的表現(xiàn),基因工程菌的遺傳不穩(wěn)定性主要表現(xiàn)在重組質粒的不穩(wěn)定性，這種不穩(wěn)定性具有下列兩種表現(xiàn)形式： 結構不穩(wěn)定性 重組DNA分子上某一區(qū)域發(fā)生缺失、重排、修飾， 導致其表觀生物學功能的喪失。 分裂不穩(wěn)定性 整個重組DNA分子從受體細胞中逃逸（curing）,四、基因工程菌的穩(wěn)定性,?,受體細胞中的限制修飾系統(tǒng)對外源重組DNA分子的 降解 外源基因的高效表達嚴重干擾受體細胞正常的生長 代謝 能量、物質的匱乏和外源基因表達產物的毒性誘導受體細胞產生應激反應：關閉合成途徑，啟動降解程序,四、基因工程菌的穩(wěn)定性,重組工程菌的遺傳不穩(wěn)定性的產生機制,?,重組工程菌的遺傳不穩(wěn)定性的產生機制,重組質粒在受體細胞質粒分裂時的不均勻分配 這是重組質粒逃逸的基本原因 受體細胞中內源性的轉座元件促進重組分子的缺失 重排,四、基因工程菌的穩(wěn)定性,?,重組質粒的逃逸率,當含有重組質粒的工程菌在非選擇性條件下生長時，培養(yǎng)系統(tǒng)中一部分細胞不再攜帶重組質粒，這些空載細胞數(shù)與總細胞數(shù)之比稱為重組質粒的宏觀逃逸率。,四、基因工程菌的穩(wěn)定性,?,重組質粒的逃逸率,重組質粒逃逸的原因有： 高溫培養(yǎng)、表面活性劑（SDS）、藥物（利福平）、 染料促進重組質粒滲透 受體細胞中的核酸酶降解重組質粒 重組質粒在受體細胞分裂時不均勻分配，細胞所含重 組質?？截悢?shù)的差異隨著細胞分裂次數(shù)增多而加劇,四、基因工程菌的穩(wěn)定性,?,質粒穩(wěn)定性分析方法： 將工程菌培養(yǎng)液樣品適當稀釋，均勻涂布于不含抗性標記抗生素的平板培養(yǎng)基，培養(yǎng)10~12h，然后隨機挑選100個菌落接種到含抗性標記抗生素的平板培養(yǎng)基上，統(tǒng)計長出的菌落數(shù)。每一個樣品應取3次重復的結果，計算出比值，該比值反映了質粒的穩(wěn)定性。,四、基因工程菌的穩(wěn)定性,?,影響基因工程穩(wěn)定性的因素,遺傳特性,載體的性質 宿主的選擇 外源基因整合到宿主染色體,發(fā)酵工藝,培養(yǎng)基 生長速率 限制性基質 溫度 pH和溶氧 外源基因表達,四、基因工程菌的穩(wěn)定性,?,培養(yǎng)基,一些基因重組菌在復合培養(yǎng)基中顯示較高的質粒穩(wěn)定性,微生物在含有有機氮源如酵母抽提物、蛋白胨等營 養(yǎng)豐富的復合培養(yǎng)基中培養(yǎng)時，由于培養(yǎng)基提供了生長 必須的氨基酸和其他物質，微生物的生長較在基本培養(yǎng) 基中快。,四、基因工程菌的穩(wěn)定性,?,比生長速率,基因重組細菌的比生長速率對質粒穩(wěn)定性有很大的影 響。提高比生長速率有助于提高質粒穩(wěn)定性。 基因重組細菌的比生長速率與培養(yǎng)環(huán)境有關，如溫度 、pH，溶氧，限制性營養(yǎng)物質濃度，有害代謝產物濃度等 。在一定的溫度和pH下，限制性基質濃度往往是決定比生 長速率的主要因素。,四、基因工程菌的穩(wěn)定性,?,限制性基質,一般培養(yǎng)基中各成分并不是完全平衡的，經過一段時間的培養(yǎng)，微生物的生長通常會受到一種或是幾種物質的限制。 限
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