【正文】 位體積的菌體數(shù)量 的成倍增加來實(shí)現(xiàn)總表達(dá)量的提高。 對蛋白質(zhì)序列進(jìn)行改造需要有基本的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù) 據(jù)，而目前這方面的數(shù)據(jù)庫還不完整。酶法成本比較高且加入的酶蛋白還必須分離去除。 融合表達(dá)使目標(biāo)蛋白的構(gòu)象與天然狀態(tài)不一樣，導(dǎo)致 生物比活力降低，甚至沒有活性。主要 表現(xiàn)為： 大腸桿菌對分子量較大的目標(biāo)蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)和分泌效率 一般比較低，不能滿足大規(guī)模制備的需要。 在較低的溫度下培養(yǎng)菌體和優(yōu)化發(fā)酵條件。 共表達(dá)能提高特定目標(biāo)穩(wěn)定性的輔助因子，如分子伴侶基因。,共表達(dá)大腸桿菌稀有密碼子tRNA基因,?,利用蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)把目標(biāo)蛋白最終積累在周質(zhì)空間，或分泌到培養(yǎng)基 采用缺乏某些蛋白水解酶基因的缺陷株作為宿主菌。 通過對已知大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)半衰期的蛋白質(zhì)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)N末端為Arg、Lys、Leu、Phe、Tyr、Trp殘基的蛋白質(zhì)，含有Pro、Glu、Ser、Thr豐富區(qū)的蛋白質(zhì)降解，穩(wěn)定性較差。 由于大腸桿菌防御體系的自身保護(hù)作用，大腸桿菌中的核酸酶和蛋白質(zhì)水解酶能夠降解目標(biāo)基因 mRNA 和目標(biāo)基因產(chǎn)物，這種降解作用程度對不同的基因或蛋白質(zhì)而言是不同的，具有一定的專一性和選擇性。因?yàn)橄∮忻艽a子存在的位置、分布的均勻性、mRNA的二級結(jié)構(gòu)的不同決定了它對翻譯是有差別的。 人尿激酶原 ProUK，新型組織纖溶酶原激活劑NTA等基因中都含有較多的 AGG 和 AGA 密碼子，在大腸桿菌中直接表達(dá)的水平很低，但在大腸桿菌中共表達(dá) tRNA Arg（AGG/AGA）基因argU后，這些基因的表達(dá)水平能明顯得到提高。 在表達(dá)系統(tǒng)中共表達(dá)稀有密碼子tRNA基因，以提高大腸桿 菌細(xì)胞內(nèi)稀有密碼子tRNA的豐度。,表達(dá)質(zhì)粒的優(yōu)化和設(shè)計(jì),?,共表達(dá)大腸桿菌稀有密碼子tRNA基因,表達(dá)水平高的基因呈現(xiàn)的密碼子偏愛性高于表達(dá)水平低的基因,現(xiàn)已闡明的在大腸桿菌中的稀有密碼子有： 編碼 Arg 的密碼子 AGA、AGG、CGA、CGG 編碼 Pro 的密碼子 CCC、CCU、CCA 編碼 Cys 的密碼子 UGU、UGC 編碼 Gly 的密碼子 GGA、GGG 編碼 Leu 的密碼子 CUA、CUC 編碼 IIe 的密碼子 AUA 編碼 Ser 的密碼子 UCA、AUG、UCG、UCC 編碼 Thr 的密碼子 ACA,?,由于同義密碼子的使用頻率與細(xì)胞內(nèi)對應(yīng)的tRNA的豐度 有正比關(guān)系，稀有密碼子對應(yīng)的tRNA的豐度很低，有可能在 翻譯過程中發(fā)生中止和移碼突變。這一方法通常適用于目標(biāo)基因5’端序列容易形成二級結(jié)構(gòu)，而又不宜改變其序列的情形下。,表達(dá)質(zhì)粒的優(yōu)化和設(shè)計(jì),?,在必要的情況下，還可通過頂點(diǎn)突變，PCR等技術(shù)改變個別關(guān)鍵的堿基來破壞mRNA 5‘端的“莖環(huán)”結(jié)構(gòu)。,表達(dá)質(zhì)粒的優(yōu)化和設(shè)計(jì),?,核糖體結(jié)合位點(diǎn)本身和附近的序列決定了目標(biāo)基因mRNA 5’端的二級結(jié)構(gòu)，研究表明mRNA 5‘端形成的“莖環(huán)”結(jié)構(gòu)阻礙了mRNA與核糖體30S亞基的結(jié)合，從而抑制了翻譯的起始。 ATG與UAAGGAGG至少相隔3~4個堿基，與AAGAA至少相隔5個堿基mRNA的翻譯才能進(jìn)行。 核糖體結(jié)合位點(diǎn)序列的變化對mRNA的翻譯效率有顯著影響，,表達(dá)質(zhì)粒的優(yōu)化和設(shè)計(jì),?,具體表現(xiàn)為： SD序列UAAGGAGG的翻譯效率要比AAGGA高3~6倍。 由于每一個基因都具備各自獨(dú)特的5‘端結(jié)構(gòu)，最終構(gòu)建成的各種表達(dá)質(zhì)粒所具有的核糖體結(jié)合位點(diǎn)是一個變量。高效表達(dá)目標(biāo)基因的戰(zhàn)略和技術(shù),表達(dá)質(zhì)粒的優(yōu)化和設(shè)計(jì) 共表達(dá)大腸桿菌稀有密碼子 tRNA基因 提高目標(biāo)基因mRNA和目標(biāo)基因產(chǎn)物的穩(wěn)定性 高密度發(fā)酵和工程化宿主細(xì)胞,?,表達(dá)質(zhì)粒的優(yōu)化和設(shè)計(jì),在各種表達(dá)載體中，啟動子和SD序列的下游都設(shè)計(jì)了一段含有各種限制性酶切位點(diǎn)的序列，用于目標(biāo)基因的插入。這一插入位點(diǎn)附近的序列將成為核糖體結(jié)合位點(diǎn)的一部分，因此它對構(gòu)建高效表達(dá)質(zhì)粒是至關(guān)重要的。,?,表達(dá)質(zhì)粒的優(yōu)化和設(shè)計(jì),?,表達(dá)質(zhì)粒的優(yōu)化和設(shè)計(jì),?,構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒時首先要考慮使目標(biāo)基因的翻譯起始密碼ATG與SD序列之間的距離和堿基組成處于一個適當(dāng)?shù)姆秶?翻譯起始密碼ATG與UAAGGAGG的最適距離是6~8個堿基長度，與AAGAA的最適距離是5~7個堿基長度。 ATG與SD序列之間的堿基組成為A、T堿基豐富時，mRNA翻譯效率較高。 盡量提高核糖體結(jié)合位點(diǎn)本身和附近的序列中A/T堿基的含量，降低mRNA 5’端形成的“莖環(huán)”結(jié)構(gòu)的可能性，也是構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒時需要注意的事項(xiàng)。 把目標(biāo)基因設(shè)計(jì)成多順反子結(jié)構(gòu)，在大腸桿菌本身的高效翻譯起始元件后加上第二個SD序列和目標(biāo)基因，一起插入表達(dá)載體。,表達(dá)質(zhì)粒的優(yōu)化和設(shè)計(jì),?,在構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒時，充分利用各個基因的結(jié)構(gòu)特征和特點(diǎn)，注意引入翻譯增強(qiáng)子序列 能提高mRNA翻譯效率的特殊核苷酸序列，稱為翻譯增強(qiáng)子。 解決這一問題的辦法： 通過基因突變把稀有密碼子改變?yōu)槠渌褂妙l率的同義密 碼子。,共表達(dá)大腸桿菌稀有密碼子tRNA基因,?,在所有的大腸桿菌稀有密碼子tRNA中，tRNA Arg（AGG/AGA）含量最少，而AGG和AGA密碼子在真核基因中經(jīng)常出現(xiàn)。,共表達(dá)大腸桿菌稀有密碼子