第二章基因工程制藥新版7-展示頁
2024-11-19 22:12本頁面
【正文】 低蛋白之間的相互作用所產(chǎn)生的聚集，大大提高了復(fù)性率。 加入氧化還原轉(zhuǎn)換試劑：如還原型谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽 加入氧化型谷胱甘肽：可使氧化型谷胱甘肽與還原的蛋白質(zhì)半胱氨酸之間形成二硫復(fù)合物，而后在復(fù)性過程中除去谷胱甘肽和變性劑，并加入低濃度的半胱氨酸取代蛋白質(zhì)SS谷胱甘肽中的谷胱甘肽而使二硫鍵正確形成。 復(fù)性前用稀釋、透析等方法去除變性劑和還原劑，促進(jìn)蛋白復(fù)性。減少聚集最直接的方法就是降低蛋白濃度，當(dāng)?shù)鞍诐舛仍?050181。,三、包含體蛋白復(fù)性方法,幾個(gè) 要求： 活性蛋白的回收率高 正確的復(fù)性的產(chǎn)物易于與錯(cuò)誤的折疊蛋白質(zhì)分離。 含有半胱氨酸的蛋白質(zhì)，需要加入還原劑巰基乙醇、二硫蘇糖醇等。 包含體的溶解 打斷包含體蛋白分子內(nèi)和分子間的各種化學(xué)鍵，使多肽鏈伸展。當(dāng)除去變性劑時(shí)，一部分蛋白質(zhì)可自動折疊成具有活性的正確構(gòu)型，此折疊過程為蛋白質(zhì)的復(fù)性。,包含體的組成與特性： 一般含有50%以上的重組蛋白，其余為核糖體元件、RNA聚合酶、外膜蛋白o(hù)mpC、ompF和ompA等，環(huán)狀或缺口的質(zhì)粒DNA，以及脂體、脂多糖等，大小為0.51um，無定形，難溶與水，只溶于變性劑如尿素、鹽酸胍等。,一、包含體及包含體形成原因,包含體定義: 細(xì)胞內(nèi)不溶性表達(dá),即蛋白在不適宜于折疊的環(huán)境中表達(dá)后形成不溶性產(chǎn)物。欲獲得天然活性態(tài)的目標(biāo)產(chǎn)物,必需分離包含體后,溶解包含體并使其中的目標(biāo)蛋白恢復(fù)應(yīng)有的天然活性。,包含體是無定形的蛋白質(zhì)的聚集,不被任何膜所包圍。第三節(jié) 基因工程制藥生產(chǎn)的基本過程,一、工具酶的分離純化 二、載體的分離純化 三、外源DNA和目的基因的分離和獲得 四、外源DNA與載體DNA的切割與連接 五、宿主細(xì)胞的選擇和基因?qū)氩僮?六、基因工程菌的穩(wěn)定性及生長代謝的特點(diǎn) 七、基因工程菌中試 八、基因工程菌的擴(kuò)增和發(fā)酵生產(chǎn) 九、基因工程藥物的分離和純化技術(shù) 十、變性蛋白的復(fù)性 十一、基因工程藥物的質(zhì)量控制 十二、基因工程藥物的制造實(shí)例,十、變性蛋白的復(fù)性,一、包含體及包含體形成原因 二、包含體的分離和溶解 三、包含體蛋白復(fù)性方法,以大腸桿菌作為表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)基因工程藥物時(shí),藥物蛋白通常會形成無活性的蛋白聚體即包含體,它們的一級結(jié)構(gòu)即氨基酸序列是正確的,但空間結(jié)構(gòu)錯(cuò)誤,沒有生物學(xué)活性。需要一個(gè)復(fù)性過程才能得到生物活性蛋白。細(xì)胞破碎后,包含體呈顆粒狀,致密,低速離心就可獲得。,包含體的優(yōu)勢： 富集目標(biāo)蛋白：包含體具有高密度，易于分離純化的優(yōu)勢； 抗蛋白酶：重組蛋白以包含體的形式存在有效地抵御了大腸桿菌中的蛋白酶對目的蛋白的降解； 對宿主毒性小：生產(chǎn)那些處于天然構(gòu)象對宿主細(xì)胞有毒害的蛋白有優(yōu)勢。 包含體形成原因： 蛋白高水平表達(dá)時(shí) 新生肽鏈的聚集速率﹥蛋白正確折疊速率 包含體形成 重組蛋白在大腸桿菌中表達(dá)時(shí)，缺少一些折疊所需的酶和輔助因子（折疊酶和分子伴侶）。,二、包含體的分離和溶解,包含體難溶于水中，在變性劑溶液（如鹽酸胍、脲）中才能溶解，溶解的蛋白質(zhì)呈變性狀態(tài)，即所有的氫鍵、疏水鍵被破壞，疏水側(cè)鏈完全暴露，但一級結(jié)構(gòu)和共價(jià)鍵不被破壞。,包含體的分離 收集重組菌，破碎細(xì)胞；離心除上清；使用變性劑洗滌沉淀。,溶解采用強(qiáng)的變性劑，如脲、鹽酸胍或硫氰酸鹽，SDS，各種溶解方法都各有利弊。 加入金屬螯合劑EDTA去除金屬離子。 折疊復(fù)性后應(yīng)得到濃度較高的蛋白質(zhì)產(chǎn)品 復(fù)性過程耗時(shí)少,1 稀釋、透析復(fù)性法 2 含二硫鍵的蛋白復(fù)性 3 封閉蛋白的疏水簇促進(jìn)復(fù)性 4 凝膠過濾層析復(fù)性 5 小分子添加劑促進(jìn)復(fù)性 6 分子伴侶或折疊酶促進(jìn)的復(fù)性 7 人工分子伴侶促進(jìn)的復(fù)性 8 減緩蛋白合成速率,1 稀釋、透析復(fù)性法,高蛋白濃度將導(dǎo)致蛋白的聚集，復(fù)性時(shí)，變性蛋白經(jīng)一系列的折疊中間體，最終形成蛋白天然構(gòu)象。g/ml時(shí)，可獲得較高復(fù)性率。,2 含二硫鍵的蛋白復(fù)性,正確的二硫鍵重建方法： 空氣氧化法：利用空氣中的氧氣氧化折疊期間的巰基。 亞硫酸鈉/連四硫酸鈉:使變性蛋白質(zhì)磺化以保護(hù)巰基，復(fù)性時(shí)加入少量的還原試劑可移去保護(hù)基團(tuán)而使二硫鍵正確配對 加入DTT還原劑,3 封閉蛋白的疏水簇促進(jìn)復(fù)性,蛋白結(jié)構(gòu)和序列分析來確定蛋白分子中能引起分子間相互作用的疏水簇，可用特異性結(jié)合疏水族的單克隆抗體來封閉疏水簇，從而減少分子間結(jié)合引起的聚集。,5 小分子添加劑促進(jìn)復(fù)性,小分子添加劑可作為穩(wěn)定蛋白的活性狀態(tài)，降低非正確折疊分子的穩(wěn)定性，增加折疊中間體的穩(wěn)定性。,6 分子伴侶或折疊酶促進(jìn)的復(fù)性,分子伴侶和折疊酶在體外幫助蛋白復(fù)性從而提高復(fù)性率，但復(fù)性后的分離較繁，如分子伴侶或折疊酶不能重復(fù)利用，將增加成本。,8 減緩蛋白合成速率,降低發(fā)酵溫度、使用弱啟動子、降低基因劑量等可避免或減少包含體形成,十一、基因工程藥物的質(zhì)量控制,（一）原材料的質(zhì)量控制 （二）培養(yǎng)過程的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn) （三）純化過程中的質(zhì)量控制
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