第二章基因工程制藥(二)-展示頁(yè)
2024-11-19 22:12本頁(yè)面
【正文】 毒害作用。調(diào)節(jié)表達(dá)物質(zhì)的積累與細(xì)胞的生長(zhǎng)和代謝之間的平衡有利于外源基因的高效表達(dá)。,3,第二章 基因工程制藥,外源基因的表達(dá)效率,啟動(dòng)子的強(qiáng)弱 核糖體接合位點(diǎn)的有效性 SD序列和起始密碼ATG的間距 密碼子組成,4,第二章 基因工程制藥,表達(dá)產(chǎn)物的穩(wěn)定性,利用大腸桿菌的信號(hào)肽或某些真核多肽中自身的信號(hào)肽，把真核基因產(chǎn)物運(yùn)輸?shù)桨麧{周質(zhì)的空隙中，而使外源蛋白不易被酶降解； 組建融合基因，產(chǎn)生融合蛋白； 采用位點(diǎn)特異性突變的方法，改變真核蛋白二硫鍵的位置，從而增加蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性； 選用蛋白酶缺陷型大腸桿菌為宿主細(xì)胞。第二章 基因工程制藥 (二）,1,第二章 基因工程制藥,影響目的基因在大腸桿菌中 表達(dá)的因素,外源基因在宿主中的表達(dá)受許多因素影響的，所以在建立表達(dá)體系時(shí)要綜合考慮各種因素的作用，建立一個(gè)合適的表達(dá)體系，從而使外源基因得到最大的表達(dá)量，獲得最多的表達(dá)產(chǎn)物。,2,第二章 基因工程制藥,外源基因的拷貝數(shù),外源基因是克隆到載體上的，所以載體在宿主中的拷貝數(shù)就直接與外源基因的表達(dá)相關(guān)，應(yīng)將外源基因克隆到高拷貝的質(zhì)粒載體上，這對(duì)于提高外源基因的總體表達(dá)水平非常有利。,5,第二章 基因工程制藥,細(xì)胞的代謝負(fù)荷,外源基因的表達(dá)產(chǎn)物屬于異己物質(zhì)，并可能對(duì)宿主細(xì)胞有毒性。 另外通過(guò)將細(xì)胞的生長(zhǎng)和外源基因的表達(dá)分成兩個(gè)階段，或?qū)⑺拗骷?xì)胞的生長(zhǎng)與重組質(zhì)粒的復(fù)制分開(kāi)兩種手段也可以減輕細(xì)胞代謝的負(fù)荷。,6,第二章 基因工程制藥,工程菌的培養(yǎng)條件,除宿主、載體和克隆基因三者之間的關(guān)系影響外源基因的高水平表達(dá)外，培養(yǎng)條件亦是非常值得研究的因素。,7,第二章 基因工程制藥,真核基因在大腸桿菌中的表達(dá)形式,三種表達(dá)形式： 融合蛋白 非融合蛋白 分泌型。 優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)便，表達(dá)蛋白在菌體內(nèi)穩(wěn)定，易實(shí)現(xiàn)高效表達(dá)。原核多肽序列可能會(huì)影響真核蛋白的免疫原性。,9,第二章 基因工程制藥,非融合蛋白形式表達(dá)藥物基因,非融合蛋白指在大腸桿菌中表達(dá)的蛋白質(zhì)以真核蛋白的mRNA的AUG為起始，在其氨基端不含細(xì)菌多肽序列。 缺點(diǎn)：易被蛋白酶破壞。 優(yōu)點(diǎn)：在周質(zhì)中穩(wěn)定，有活性，不 含蛋氨酸殘基。,11,第二章 基因工程制藥,酵母中的基因表達(dá),載體： 酵母載體是可以攜帶外源基因在在酵母細(xì)胞內(nèi)保存和復(fù)制，并隨酵母分裂傳遞到子代細(xì)胞的DNA 或RNA單位。,12,第二章 基因工程制藥,載體的復(fù)制系列,分四類： Yep類（yeast episomal plasmid，酵母附加體質(zhì)粒） YRp類（yeast replication plasmid，酵母復(fù)制型質(zhì)粒） YCp類（yeast centromeric plasmid，酵母著絲粒質(zhì)粒） YIp類（yeast integrative plasmid，酵母整合型質(zhì)粒）,13,第二章 基因工程制藥,表達(dá)載體,普通表達(dá)載體：只能方便地引入外源基因并進(jìn)行表達(dá)，對(duì)表達(dá)產(chǎn)物的組成，特別是對(duì)其氮末端氨基酸是否有增減并無(wú)嚴(yán)格要求。,14,第二章 基因工程制藥,影響目的基因在酵母菌中表達(dá)的因素,外源基因的拷貝數(shù) 外源基因的表達(dá)效率 外源蛋白的糖基化 宿主菌株的影響,15,第二章 基因工程制藥,外源基因的拷貝數(shù),拷貝數(shù)要適當(dāng)，高拷貝數(shù)的質(zhì)粒載體可使外源基因高效表達(dá)，但會(huì)引起細(xì)胞生長(zhǎng)量的降低，單拷貝的質(zhì)粒載體對(duì)細(xì)胞的最大生長(zhǎng)沒(méi)有影響，能達(dá)到較高效的表達(dá)。 分泌信號(hào)包括信號(hào)肽部分以及前導(dǎo)肽部分的編碼序列，它幫助后面的表達(dá)產(chǎn)物分泌出酵母細(xì)胞，并在適當(dāng)?shù)牟课挥砂?
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