基因工程制藥新版(1)(編輯修改稿)
2025-06-22 06:01 本頁面
【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 （ 1）借助同型多聚體尾巴的連接方法 用 3末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶 催化，在 cDNA的 3’末端加上 polyG（或者 polyT）的尾巴、而在載體的末端加上 polyC（或者 polyA） 的尾巴，就能夠?qū)崿F(xiàn) cDNA的片段與載體 DNA的連接。 （ 2）加人工接頭的連接法 所謂加 人工接頭 的連接法，是指用采用 T4DNA連接酶，在 cDNA的末端加上人工接頭，然后再使用特定的限制酶來 切出粘性末端 ，從而實(shí)現(xiàn)與載體 DNA的連接。 E、將重組體導(dǎo)入宿主細(xì)胞 λ 噬菌體感染大腸桿菌形成 噬菌斑 。以便于使得質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌內(nèi)。 F、 cDNA文庫的鑒定 表型鑒定法： （ 1）抗性基因失活法 （ 2）菌落顏色 （ 3）噬菌斑顏色改變 分子鑒定法： （ 1）凝膠電泳 （ 2）分子雜交 （ 3） DNA序列測(cè)定 G、目的 cDNA克隆的分離和鑒定 （ 1） 核酸探針雜交法 根據(jù)目的蛋白質(zhì)純品的氨基酸序列分析結(jié)果，人工 合成相應(yīng)的單鏈寡核苷酸 作為 探針 ，從 cDNA文庫分離特異的cDNA克隆。 （ 2） 特異親合鑒定法 對(duì)于那些表達(dá)水平低 ,不能純化得到足量蛋白質(zhì)的進(jìn)行序列測(cè)定 ,利用一種能與 靶蛋白 特異結(jié)合的 配體 ,從已構(gòu)建的表達(dá)型重組文庫中 篩選 該蛋白的基因。 ①已知的可在體內(nèi)與靶蛋白 相互作用 的蛋白 /小分子化合物 ②抗靶蛋白抗原決定簇的 IgG ③ 可被靶蛋白識(shí)別的小段 DNA序列 （ 5）逆轉(zhuǎn)錄法的實(shí)例 通過逆轉(zhuǎn)錄法，已經(jīng)合成了下列基因克隆株： （ 1）人生長(zhǎng)激素 （ 2） α 人干擾素 （ 3） β 人干擾素 （ 4）人尿激酶。 RTPCR技術(shù)法 1985， PCR發(fā)明以后， RTPCR得到了廣泛的應(yīng)用。 特點(diǎn)： mRNA反轉(zhuǎn)錄合成 cDNA第一鏈后， 不用 再合成 cDNA第二鏈 只是在特異性引物作用下，擴(kuò)增近 181。g 級(jí) 的特異 cDNA產(chǎn)物 通過 RTPCR成功克隆的基因： IL2,3,6, GCSF、 TNF、 IFNγ等 是一種在體外利用酶促反應(yīng)大量獲得特異序列的基因組 DNA或 cDNA的專門技術(shù)，又稱為無細(xì)胞的分子克隆。 聚合酶鏈反應(yīng)（ PCR） 模板 DNA 引物 4種 dNTP Taq DNA聚合酶 含 Mg2+的緩沖液。 PCR的反應(yīng)體系 （ 1） 變性 ，加熱至 95 ℃ ，使模板 DNA解開成單鏈； （ 2） 退火 ，溫度降至適宜，使引物與模板互補(bǔ)結(jié)合； （ 3） 延伸 ，溫度升至 72 ℃ ， DNA聚合酶以 4種 dNTP為底物，在引物的 3’OH上，合成與模板互補(bǔ)的DNA新鏈。 PCR的基本反應(yīng)步驟及原理 PCR反應(yīng)條件 變性 95?C 延伸 72?C 退火 Tm5?C 5? Primer 1 5? Primer 2 Cycle 2 Cycle 1 5? 5? 5? 5? 5? 5? Template DNA 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? PCR基本工作原理 Cycle 3 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 25～ 30 次循環(huán)后，模板 DNA的含量可以擴(kuò)大 100萬倍以上。 篩選新基因的其它新方法 島嶼獲救 PCR法 ? CpG島 富有 GC(60% )，有高含量的 CpG二核苷酸。 ? CpG 島含有罕見的 Eag I、 Sac I、 BssHI酶切位點(diǎn)，每個(gè)酶在 CpG島的酶切頻率為 12次 /島。 ? CpG島是很多基因 5’端的標(biāo)志。 ? 對(duì) GenBank數(shù)據(jù)庫 375個(gè)基因的統(tǒng)計(jì)，幾乎所有的看家基因與 40%的組織特異性基因與 CpG 島相關(guān)聯(lián)。 ? Alu重復(fù)較均一的散布在基因組，約每 3kb出現(xiàn) 1次。 由 CpG 島延伸至相鄰的 Alu重復(fù)的探針應(yīng)能用來分離與 CpG 島相關(guān)聯(lián)的基因。 選泡狀接頭及泡狀引物是為了保證 PCR反應(yīng)的選擇性。泡狀引物的序列與泡狀接頭里非互補(bǔ)區(qū)的一條鏈的序列相同。由于泡狀引物不能與泡狀接頭里對(duì)應(yīng)的鏈互補(bǔ)，只有 Alu引物能夠啟動(dòng) PCR反應(yīng)進(jìn)行第一個(gè)擴(kuò)增循環(huán)，其后兩個(gè)引物均能參與擴(kuò)增。這樣，不含 Alu重復(fù)的 DNA 片段將不能被擴(kuò)增。 用罕見的限制酶切酵母人工染色體 DNA，酶切片斷連上泡狀接頭，用泡狀引物和 Alu特異引物 PCR擴(kuò)增。 所擴(kuò)片斷經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離，找出特異片段來篩選cDNA文庫 。 酶切片斷連上泡狀接頭 用泡狀引物和 Alu特異引物 PCR擴(kuò)增 罕見的限制酶切 凝膠分離特異片段篩選 cDNA文庫 獲得特異片段 此法會(huì)漏掉不含 CpG島的基因。 如果 Alu重復(fù)與 CpG 島相距太遠(yuǎn)而無法PCR擴(kuò)增，相應(yīng)的基因也會(huì)漏掉。 此法對(duì)分離基因 5’端十分有利，而基因5’端常是最難克隆的。 粘粒 DNA庫經(jīng)限制酶酶切(也可不用酶切，用超聲處理并補(bǔ)平 )并連上接頭，然后用5’生物素標(biāo)記的引物 (與接頭1個(gè)臂的序列相同 )做 PCR擴(kuò)增。 cDNA文庫插入片斷也用載體引物行 PCR，然后與生物素標(biāo)記的基因組片段雜交。 基因組 DNAcDNA復(fù)合物用鏈霉抗生物素蛋白覆蓋的磁珠捕捉。除掉未結(jié)合的非特異性 cDNA。捕捉到的cDNA洗脫后用載體
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