基因工程制藥新版ppt課件(編輯修改稿)
2025-02-04 04:33 本頁(yè)面
【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 2步： （ A）人工脂質(zhì)體的制備 （ B）脂質(zhì)體與宿主細(xì)胞的融合 （ A）人工脂質(zhì)體的制備 在含有 重組 DNA分子的水溶液中 + 磷脂 + 吐溫 80（乳化劑） ↓ 通過(guò)激烈攪拌或者超聲波處理，將磷脂分散到水溶液之中 ↓ 再經(jīng)過(guò)靜置，磷脂分子群聚形成液晶態(tài)脂質(zhì)雙層薄膜 ↓ 將 DNA包埋在薄膜之中形成 微囊 。就是 人工脂質(zhì)體 。 （ B）脂質(zhì)體與宿主細(xì)胞的融合 將 脂質(zhì)體微囊 與 宿主細(xì)胞 混合，在 PEG、或者在其它 促融劑 的作用下，經(jīng)過(guò)一定條件就會(huì)產(chǎn)生融合作用，最終將重組DNA導(dǎo)入到宿主細(xì)胞之中。 （ 4）脂質(zhì)體介導(dǎo)的應(yīng)用 對(duì)于一些微生物如 放線菌細(xì)胞 ，由于無(wú)法形成感受態(tài)，也就不能通過(guò)轉(zhuǎn)化作用導(dǎo)入外源性 DNA。但是，通過(guò)脂質(zhì)體介導(dǎo)方法，就能實(shí)現(xiàn)脂質(zhì)體與放線菌細(xì)胞之間的融合，來(lái)獲得 基因工程放線菌 。 ? 脂質(zhì)體 2022: Invitrogen , 規(guī)格顯微鏡注射技術(shù) 在特定的顯微鏡下，用 特制的玻璃微管 ，將 重組的 DNA直接注射到宿主細(xì)胞內(nèi)的方法。 顯微鏡注射技術(shù)是一種直接、簡(jiǎn)單、而又準(zhǔn)確、可靠的 DNA機(jī)械轉(zhuǎn)移技術(shù)。 主要用于真核生物 是一種全新的基因?qū)爰夹g(shù)，它把 DNA包被在金或鎢的微粒中 ，然后由基因槍將此包被顆粒轉(zhuǎn)移到原位組織、細(xì)胞或細(xì)胞器中，是目前國(guó)際上最先進(jìn)的基因?qū)爰夹g(shù)。 基因槍適用于動(dòng)植物、細(xì)胞培養(yǎng)物、胚胎、細(xì)菌及小型動(dòng)物的轉(zhuǎn)基因。具有快速、簡(jiǎn)便、安全、高效的特點(diǎn)。 基因槍注射技術(shù) 基因槍注射技術(shù) 利用脈沖電場(chǎng)提高細(xì)胞膜的通透性，從而使外源 DNA轉(zhuǎn)移至細(xì)胞中。此法簡(jiǎn)單、效率較高， 幾乎所有細(xì)胞都可用此技術(shù) ，此方法轉(zhuǎn)染的DNA不僅是線性的，還可是環(huán)狀的。 條件：電壓： 300～ 600V 維持時(shí)間： 20～ 100ms 溫度： 0℃ 電穿孔技術(shù) 磷酸鈣 — DNA共沉淀法基因轉(zhuǎn)移技術(shù) 此法受 二價(jià)金屬離子能促進(jìn)細(xì)胞吸收外源 DNA的啟發(fā)而發(fā)展起來(lái)的。當(dāng)核酸以 磷酸鈣 — DNA共沉淀物 的形式在時(shí)，細(xì)胞攝取 DNA的能力顯著加強(qiáng)。但 轉(zhuǎn)移效率較低 ，僅有 1%~5%的外源 DNA可進(jìn)入受體細(xì)胞核中，約有1%DNA可在細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)。 病毒介導(dǎo)的生物學(xué)方法 帶有外源基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒或 DNA病毒在包裝細(xì)胞內(nèi)可形成完整的病毒顆粒，并被釋放到培養(yǎng)基中，感染 哺乳動(dòng)物細(xì)胞 ，能有效實(shí)現(xiàn)基因轉(zhuǎn)移。 （三）大腸桿菌中的基因?qū)牒捅磉_(dá) 真核基因?qū)氪竽c桿菌所用的 載體 真核基因?qū)氪竽c桿菌的具體 方式 影響真核基因?qū)氪竽c桿菌的 因素 真核基因?qū)氪竽c桿菌所用的載體 （ 1） pBV220 （ 2） pET pBV220 侯云德 分子病毒學(xué)家 中國(guó)工程院院士 Ⅰ 、 Ⅱ 、Ⅳ 型 α1b、 α2a、 α2b、γ等亞型的基因工程干擾素系列產(chǎn)品 pBV220系列 及 pBV320系列通用型高效表達(dá)載體 （ 1） pBV220 已經(jīng)成功用于表達(dá) IL IL IL IL ILLFNa、 IFNr、 TNF、 GCSF、 GMCSF等多種細(xì)胞因子。 [A]、結(jié)構(gòu) [B]、優(yōu)點(diǎn) [A]、結(jié)構(gòu) pBV220共 3665bp。共由 6個(gè)部份組成： （ 1） pUC8的 MCS （ 2）核糖體 rrnB終止信號(hào) （ 3） pBR322的第 42523735位 （ 4） pUC18的第 2066680位 （ 5） λ噬菌體 cIts抑制基因 +PR啟動(dòng)子 （ 6） pRC23的 PL啟動(dòng)子 +SD序列 。 質(zhì)粒 pBV220的結(jié)構(gòu)框 ori復(fù)制起始點(diǎn) clts857抑制子基因 ，在 31℃ 時(shí)，其基因產(chǎn)物具有 阻抑 PL活性，當(dāng)溫度升高時(shí)，這種阻抑活性就喪失，PL開(kāi)始指導(dǎo)合成 mRNA。 PR啟動(dòng)子 1 PL啟動(dòng)子 2 BglII、 EcoRI、 SmaI、 BamHI、SalI 、 HindIII、 PstI限制酶切位點(diǎn)形成 多克隆區(qū)域 ，在此插入外源性目的基因。 RrnB核糖體終止基因（ 終止子 ） PvuI青霉素抗性基因 Ampr。 [B]、優(yōu)點(diǎn) （ 1） 可轉(zhuǎn)化任何菌株 （ 2）能 防止出現(xiàn) “ 通讀 ” 現(xiàn)象 （ 3）質(zhì)粒分子量很小，有利于 增加其拷貝數(shù)量 （ 4） 能插入大片段的外源基因 （ 2） pET pET被認(rèn)為是最有潛力的系統(tǒng)。來(lái)源于 T7 噬菌體 。 [A]、 克隆宿主 可用大腸桿菌 K12的 HB10 JM103等細(xì)胞。 pET克隆到宿主體內(nèi)之后，不會(huì)造成宿主的細(xì)胞損傷。 [B]、表達(dá)受宿主細(xì)胞的 T7 RNA聚合酶控制。 表達(dá)宿主 為 BL2 λDE30。表達(dá)菌在 LB培養(yǎng)基、或在 M9培養(yǎng)基中生長(zhǎng)良好。 [C]、表達(dá)產(chǎn)物可以用金屬絡(luò)合物的方式進(jìn)行分離，能夠達(dá)到高純度、高收率。 MCS pET32 a(+)以 T7lac作為啟動(dòng)子； pET32 a(+) 還帶有 HisTag融合標(biāo)簽 ，此類標(biāo)簽可用于檢測(cè)和純化相關(guān)目的蛋白； pET32a(+) 上與目的基因共表達(dá)的 硫氧還蛋白可以促進(jìn)二硫鍵形成，增加目的蛋白可溶性，便于分離純化。 真核基因?qū)氪竽c桿菌具體方式 共有 3種 方式 （ 1）融合蛋白 （ 2）非融合蛋白 （ 3）分泌型表達(dá)蛋白 （ 1）融合蛋白 [A]、定義 [B]、優(yōu)缺點(diǎn) [C]、改進(jìn)措施 [D]、融合蛋白的具體表達(dá)方式 [A]、定義 是指產(chǎn)生的蛋白質(zhì)同
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