【正文】 第二章 基因工程 的載體 1 載體 ? 在基因工程操作中，把能攜帶外源 DNA進入受體細胞的 DNA分子叫 載體（ vector）。 2 基因工程對載體 的要求 ? （ 1）在宿主細胞內(nèi)能獨立復制。 ? 復制子：載體上有特殊的復制起點，使其能夠攜帶外源基因在宿主細胞中獨立復制繁殖 ? （ 2）有利于檢測篩選的標記。 ? （ 3）有一段多克隆位點。 便于外源 DNA插入載體而不影響載體的復制。 ? （ 4）分子量小，拷貝數(shù)多。 ? （ 5）容易從宿主細胞中分離純化。 3 載體的種類 按照來源分為： 按照功能分為： ? 質(zhì)粒（ plasmid） ? 單鏈 DNA噬菌體 M13 ? ?噬菌體的衍生物 ? 柯斯質(zhì)粒（ cosmid） ? 動物病毒（ virus） ? 克隆載體 : 克隆一個基因或 DNA片斷 ? 表達載體 : 用于一個基因編碼的蛋白表達 ? 整合載體 : 把一個基因插入到染色體組中 4 載體的分類 分類依據(jù) 類 別 舉 例 （ 1） 克隆載體 （ 2） 表達載體 pBR322 pCDN3 （ 1） 原核載體 （ 2） 真核載體 （ 3） 穿梭載體 pUC18 pBUDCE41 YEC 質(zhì)粒 （ plasmid） 單鏈 DNA噬菌體 M13 λ 噬菌體的衍生物 柯斯質(zhì)粒 （ cosmid） 動物病毒 （ virus） （克隆能力）分 (1)1kb (2)10kb (3)22kb (4)50kb (5) (6) (1)M13 (2)plasmid (3)λ phage (4)casmid (5)BAC (6)YAC 5 說明： （ shuttle vector） 指能在兩種宿主生物體內(nèi)復制的載體分子 ， 因而可以運載目 的 基 因 穿 梭 往 返 兩 種 生 物 之 間 ， 如：YEP,DIDB219 Yeast Artificial Chromsome 由酵母基因和 pBR322質(zhì)粒衍生物構成 ， 對克隆大的真核基因十分有用 ， 在 HGP中發(fā)揮主要作用 。 細菌人工染色體 。 6 第一節(jié) 質(zhì)粒載體 7 ? 質(zhì)粒（ plasmid） ：指細菌等生物細胞內(nèi)一類獨立于染色體外而能自我復制的遺傳物質(zhì)。 （ 1）分子?。? 一、質(zhì)粒的一般生物學特性 1—200 kb （ 2）編碼基因少： 2—3個中等大小的蛋白質(zhì)。 （ 3）環(huán)形狀： 雙鏈環(huán)狀 DNA。 （酵母的“殺傷質(zhì)?！笔?RNA）。 如抗菌素抗性、代謝特征等，賦予細菌一些額外的特性（非必須）。 8 （ 4）質(zhì)粒的空間構型： ① 共價閉合環(huán)狀 DNA（ cccDNA) 呈超螺旋（ SC）（ super coil） Covalent close circular DNA 9 ③ 線形 DNA （ linear ， lDNA） 一條鏈上有一至數(shù)個缺口。 ② 開環(huán) DNA（ open circular， ocDNA） 10 （ 5）質(zhì)粒空間構型與電泳速率 同一質(zhì)粒盡管分子量相同，不同的構型電泳遷移率不同： scDNA最快、 l DNA次之、 ocDNA最慢。 SC OC L 11 L OC SC 12 二、質(zhì)粒的類型 在大腸桿菌中的質(zhì)粒，可以分為： 接合型質(zhì)粒 : 非接合型質(zhì)粒 能自我轉(zhuǎn)移 不能自我轉(zhuǎn)移 13 除了帶有自我 復制 所必需的遺傳信息外還帶有一套控制細菌 配對 和質(zhì)粒 接合轉(zhuǎn)移 的基因。 如： F質(zhì)粒（性質(zhì)粒、或 F因子）： 甚至能使寄主染色體上的基因隨其一道轉(zhuǎn)移到原先不存在該質(zhì)粒的受體菌中。 又叫 自我轉(zhuǎn)移型質(zhì)粒 。 1. 接合型質(zhì)粒： 不符合基因工程的安全要求。 14 大腸桿菌接合（ conjunction） 15 2. 非接合型質(zhì)粒： 雖然帶有自我 復制 所必需的遺傳信息，但失去了控制細菌配對和質(zhì)粒接合 轉(zhuǎn)移 的基因，因此不能從一個細胞轉(zhuǎn)移到另一個細胞。 （ 1） R質(zhì)粒（抗性質(zhì)粒）： 帶有一種或數(shù)種 抗生素抗性基因 ，使寄主獲得同樣的抗生素抗性性狀（ resistance）。 符合基因工程的安全要求。 16 17 帶有控制 大腸桿菌素（ colicin） 合成的基因。 （ 2） Col質(zhì)粒： 大腸桿菌素對不帶 Col質(zhì)粒的大腸桿菌有毒。 Col質(zhì)?；?R質(zhì)粒如果帶有轉(zhuǎn)移基因，也可以成為接合型質(zhì)粒。 18 三、質(zhì)粒的復制類型 1. 嚴緊型質(zhì)粒（ stringent plasmid） 拷貝數(shù)少 ，只有 1—3份拷貝。 2. 松弛型質(zhì)粒（ relaxed plasmid） 拷貝數(shù)多 ，有 20份以上的拷貝。 （接合型質(zhì)粒分子量大，一般屬嚴緊型）。 （非接合型質(zhì)粒分子量小，一般屬松弛型）。 19 天然存在的野生型質(zhì)粒由于分子量大、拷貝數(shù)低、單一酶切位點少、遺傳標記不理想等缺陷，不能滿足克隆載體的要求，因此往往需要以多種野生型質(zhì)粒為基礎進行人工構建。 目前實驗室使用的大腸桿菌質(zhì)粒大多是由少數(shù)幾個野生型質(zhì)粒構建的： pSC101 9 kb 拷貝數(shù) 5 四環(huán)素抗性標記基因 Tcr ColE1 kb 拷貝數(shù) 20 30 大腸桿菌內(nèi)毒素標記基因 E1 RSF2124 ColE1衍生質(zhì)粒 氨芐青霉素抗性標記基因 Apr 1. 天然質(zhì)粒的局限性 四、質(zhì)粒的構建 20 21 ColE1 22 （ 1） 具有復制起點（ ori） 2. 質(zhì)粒載體必須具備的基本條件 （ 2）具有抗菌素抗性基因 （ 3）若干限制性內(nèi)切酶的單一位點： 是篩選的標志。理想的載體應該有兩種抗菌素抗性基因。 用來插入外源 DNA片斷。且插入后不影響復制功能。 23 （ 4）具有較小的分子量和較高的拷貝數(shù)。 24 A typical plasmid vector. It contains a polylinker which can recognize several different restriction enzymes, an ampicillinresistance gene (ampr) for selective amplification, and a replication origin (ORI) for proliferation in the host cell. 25 常用抗菌素的抗性工作原理 i）氨芐青霉素（ Ampicillin， Amp） 青霉素的衍生物。 通過干擾細菌細胞壁合成的末端反應，殺死 生長的細菌 。 a）抑菌原理 b）細菌抗性原理 Ampr基因編碼 ?內(nèi)酰胺酶 ，特異地切割氨芐青霉素的 ?內(nèi)酰胺環(huán)。 26 ii）氯霉素（ chloramphenicol， Cml） 通過與 50S核糖體亞基結合，干擾細胞蛋白質(zhì)的合成并阻止肽鍵的形成。殺死 生長的細菌 。 b）細菌抗性原理 Cmlr 編碼 乙酰轉(zhuǎn)移酶 ，特異地使氯霉素乙?；Щ睢? a）抑菌原理 27 a）殺菌原理 iii）卡那霉素（ kanamycin， Kan） 通過與 70S核糖體結合，導致 mRNA發(fā)生錯讀。 殺死細菌 。 b）細菌抗性原理 Kanr 編碼的 氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶 ，對卡那霉素進行修飾，阻斷其與核糖體結合作用。 28 iv）鏈霉素（ Streptomycin， Str） a）殺菌原理 通過與 30S核糖體亞基結合，導致mRNA錯譯。 殺死細菌 。 b）細菌抗性原理 Strr 編碼一種 氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶 對鏈霉素進行修飾，阻斷其與核糖體 30S亞基結合作用。 29 v）四環(huán)素（ Tetracycline， Tet） b）細菌抗性原理 a）抑菌原理 通過與 30S核糖體亞基結合，干擾細胞蛋白質(zhì)的合成并阻止肽鍵的形成。殺死 生長的細菌 。 Tetr 編碼特異性蛋白質(zhì)，對細菌的膜結構進行修飾，組止四環(huán)素通過細胞膜進入細菌細胞內(nèi)。 30 當帶有 抗菌素抗性基因 的 載體 進入受體菌后，受體菌才能生長。 不帶有 抗菌素抗性基因 的受體菌不能在含有抗菌素的培養(yǎng)基（選擇培養(yǎng)基）中生長。 抗菌素篩選原理 活 死 抗性基因 抗菌素 31 ② 遺傳標記 使受體菌發(fā)生遺傳性狀的改變的基因。 32 人工構建的質(zhì)粒載體的類型 （ 1）高拷貝數(shù)的質(zhì)粒載體 ColE pMB1派生質(zhì)粒具有高拷貝數(shù)的特點。 而且在沒有菌體蛋白質(zhì)合成的條件下（蛋白質(zhì)合成抑制劑，氯霉素等存在下）仍能復制，達到每個細胞的拷貝數(shù) 1000—3000個！ 適合大量增殖克隆基因、或需要表達大量的基因產(chǎn)物。 33 （ 2）低拷貝數(shù)的質(zhì)粒載體 但有特殊用途 : 由 pSC101派生來的載體特點是分子量小，拷貝數(shù)低。 當有些被克隆的基因的表達產(chǎn)物過多時會嚴重地影響寄主菌的正常代謝活動，導致寄主菌死亡時，就需要低拷貝的載體。 pLG33 pLG33 pHSG415等 不適合大量擴增 DNA用。 34 （ 3）失控的質(zhì)粒載體 這是一類 溫度敏感型復制控制 質(zhì)粒。 溫度低（低于 37 oC），拷貝數(shù)很少； 溫度增加（ 40 oC）時，拷貝數(shù)會很快增加到 1000個以上。 如 pBEU pBEU2。 runaway plasmid vectors 1979年 B. E. Uhlin等構建。 35 （ 4） 插入失活型質(zhì)粒載體 載體的克隆位點位于其某一個選擇性標記基因內(nèi)部。 如 pDF4 pDF4 pBR329。 抗菌素抗性 外源 DNA 無抗菌素抗性 36 （ 5） 正選擇的質(zhì)粒載體 如 pUR pTR262等。 只有帶有選擇標記基因的轉(zhuǎn)化菌細胞才能在選擇培養(yǎng)基上生長。 直接選擇轉(zhuǎn)化后的細胞。 目前通用的絕大部分質(zhì)粒載體都是正選擇載體。 Direct selection vectors 37 （ 6） 表達型質(zhì)粒載體 主要用來使外源基因表達出蛋白質(zhì)產(chǎn)物。 如果在大腸桿菌里表達，必須把所克隆的真核生物的基因置于大腸桿菌的轉(zhuǎn)錄—翻譯信號控制之下。 注意啟動子的性質(zhì)，終止子、起始密碼、終止密碼的閱讀正確。 38 復制起始點 ORI、 選擇標記、 多克隆位點 MCS 2）大腸桿菌操縱子元件 阻遏基因 I 操縱基因 O 啟動基因 P 核糖體結合位點序列（ SD） 轉(zhuǎn)錄終止信號區(qū)。 1）普通載體元件 ① 表達載體的 結構 39 40 重要的質(zhì)粒載體 ? pBR322 ? pUC18/19 41 pSP2124質(zhì)粒的 Ampr基因 1. pBR322： （ 1）元件來源 F. Bolivar和 . Rodriguez人工構建載體。 ① 復制起點 ori pMB1系列（來源于 ColE1）的 高拷貝 型復制起點 ② Ampr基因 ③ Tetr基因 pSC101的 Tetr 基因。 42 （ 2）長度 4363bp （ 3）選擇標記 氨芐青霉素和四環(huán)素抗性。 （ 4）克隆位點 其中 9個會導致 Tetr基因失活（如BamH I、 Hind Ⅲ 、 Sal I）； 3個會導致 Ampr基因失活（ Sca I、PvuI、 Pst I）。 24個克隆位點。 43 44 （ 5） pBR322的優(yōu)點 ① 雙抗菌素抗性選擇標記 插入失活，分兩次先后選擇： 沒有獲得載體的寄主細胞 ? 在 Amp或 Tet中 都 死亡。 獲得載體的寄主細胞 ? 在 Amp或 Tet其中