【正文】 第三章 基因工程載體 生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 基因工程載體的概念 把一個(gè)有用的基因（目的基因 —— 研究或應(yīng)用基因）通過基因工程手段送到生物細(xì)胞（受體細(xì)胞），需要運(yùn)載工具（交通工具）攜帶外源基因進(jìn)入受體細(xì)胞，這種運(yùn)載工具就叫載體。作為基因工程載體，質(zhì)粒至少應(yīng)該具備 復(fù)制的起始區(qū)、選擇標(biāo)記基因區(qū)、多克隆位點(diǎn)等部分。 復(fù)制的起始區(qū)： 能在宿主細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行獨(dú)立和穩(wěn)定的自我復(fù)制。 選擇標(biāo)記基因區(qū)： 可以篩選重組體。 多克隆位點(diǎn)： 方便外源基因的插入。 第一節(jié) 質(zhì)粒載體 質(zhì)粒（ plasmid）： 是獨(dú)立于染色體以外的能自主復(fù)制的雙鏈閉合環(huán)狀 DNA分子。廣泛存在于細(xì)菌、霉菌、藍(lán)藻、酵母等細(xì)胞中。 質(zhì)粒 染色體 質(zhì)粒的一般生物學(xué)特性： ?分子大小差異大： 1— 200 kb ?編碼基因少： 2— 3個(gè)中等大小的蛋白質(zhì)。 如抗菌素抗性、代謝特征等，賦予細(xì)菌一些額外的特性（非必須）。 ?形狀： 雙鏈環(huán)狀 DNA；線性雙鏈 DNA；超螺旋等。 ? 質(zhì)粒的空間構(gòu)型： ? 質(zhì)?？臻g構(gòu)型與電泳速率： 同一質(zhì)粒盡管分子量相同，不同的構(gòu)型電泳遷移率不同， scDNA最快、 lDNA次之、 ocDNA最慢。 1. 共價(jià)閉合環(huán)狀 DNA（ Covalent close circular DNA， cccDNA)，呈超螺旋（ SC）（ super coil） 2. 開環(huán) DNA（ open circular， ocDNA），一條鏈上有一至數(shù)個(gè)缺口 3. 線形 DNA（ linear， lDNA） ? 質(zhì)粒的類型： 在大腸桿菌中的質(zhì)粒，可以分為： 接合型質(zhì)粒（能自我轉(zhuǎn)移）：除了帶有自我復(fù)制所必需的遺傳信息外還帶有一套控制細(xì)菌配對(duì)和質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移的基因。 如： F質(zhì)粒（性質(zhì)粒、或 F因子）。甚至能使寄主染色體上的基因隨其一道轉(zhuǎn)移到原先不存在該質(zhì)粒的受體菌中。 不符合基因工程的安全要求。 非接合型質(zhì)粒（不能自我轉(zhuǎn)移）：雖然帶有自我復(fù)制所必需的遺傳信息，但失去了控制細(xì)菌配對(duì)和質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移的基因，因此不能從一個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到另一個(gè)細(xì)胞。 如 R質(zhì)粒（抗生素抗性質(zhì)粒）和 Col質(zhì)粒（大腸桿菌素 colicin ）。 符合基因工程的安全要求。 大腸桿菌素是大腸桿菌分泌的一類細(xì)菌素（ bacteriocin），對(duì)于其他不能分泌特異性大腸桿菌素免疫蛋白（ Immunity protein）的細(xì)菌具有殺滅作用，現(xiàn)在一般認(rèn)為有調(diào)節(jié)菌群數(shù)量的作用。 大部分大腸桿菌素由質(zhì)粒編碼，其中最著名的沒過于 pColE1 。 ? 質(zhì)粒的復(fù)制類型 嚴(yán)緊型質(zhì)粒（ stringent plasmid）： 拷貝數(shù)少，只有 1— 3份拷貝。 （接合型質(zhì)粒分子量大，一般屬嚴(yán)緊型）。 松弛型質(zhì)粒（ relaxed plasmid）： 拷貝數(shù)多，有 10— 60份拷貝。 （非接合型質(zhì)粒分子量小，一般屬松弛型）。 ? 質(zhì)粒的不相容性 又稱質(zhì)粒的不親和性，在沒有選擇壓力的情況下，兩種親緣關(guān)系密切的不同質(zhì)粒，不能夠在同一個(gè)寄主細(xì)胞系中穩(wěn)定共存，這一現(xiàn)象稱為質(zhì)粒的不相容性 ,又稱質(zhì)粒的不親和性。 ? 質(zhì)粒的復(fù)制過程 質(zhì)粒的復(fù)制主要是通過 θ型復(fù)制 和 滾環(huán)復(fù)制 兩種方式之一進(jìn)行的，其中以 θ型復(fù)制為主。在 θ型復(fù)制中，有單向半保留復(fù)制和雙向半保留復(fù)制。 Ori復(fù)制 起 點(diǎn) θ型復(fù)制 滾環(huán)復(fù)制 在革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌中大多數(shù)質(zhì)粒是以滾環(huán)方式復(fù)制。 復(fù)制起點(diǎn) (ori)區(qū)的功能 ?復(fù)制起點(diǎn)是一段特定的 DNA序列 ， 長(zhǎng)約幾百堿基對(duì) ， 在其相關(guān)的調(diào)控元件中含有由質(zhì)?；蛩拗魅旧w編碼的 、 參與 DNA合成起始調(diào)控因子的結(jié)合位點(diǎn) 。 ?在大多數(shù)質(zhì)粒中 ， 與復(fù)制有關(guān)的蛋白質(zhì)基因位于 ori序列附近 ， 因此 ori位點(diǎn)周圍的小范圍 DNA是質(zhì)粒復(fù)制所必需的 。 ?如果質(zhì)粒 DNA的大部分區(qū)域被去掉 ， 而只保留質(zhì)粒的 ori序列 ， 而且質(zhì)粒是環(huán)狀的 ， 則質(zhì)粒仍然能進(jìn)行復(fù)制 。 ?將 ori區(qū)克隆到一個(gè)不能自主復(fù)制的環(huán)狀雙鏈 DNA分子上并引入到原核細(xì)胞后 ，該重組 DNA具有自主復(fù)制能力 。 分子克隆中常用的質(zhì)粒載體就是以這種方法構(gòu)建的 ， 同時(shí)用這種方法可以確定哪部分 DNA是 ori區(qū)并研究 ori區(qū)的功能 。 ?ori區(qū)域常決定了質(zhì)粒的許多特性 ， 如質(zhì)粒的寄主范圍和質(zhì)粒的拷貝數(shù) 。 質(zhì)粒的命名 用小寫字母 p代表質(zhì)粒（ plasmid），在 p字母后用兩個(gè)大寫字母代表發(fā)現(xiàn)這一質(zhì)粒的作者或?qū)嶒?yàn)室名稱，再加上質(zhì)粒編號(hào)。如： pBR322： p表示一種質(zhì)粒，而“ BR”則是分別取自該質(zhì)粒的兩位主要構(gòu)建者 F. Bolivar和 R. L. Rodriguez， 322為編號(hào)。 質(zhì)粒載體的構(gòu)建 ?天然質(zhì)粒的局限性 分子量大，拷貝數(shù)低，第一個(gè)用于基因克隆的天然質(zhì)粒 pSC101，分子長(zhǎng) kb。 但只有一個(gè) EcoR I切點(diǎn)充當(dāng)克隆位點(diǎn)， Tetr 作為篩選標(biāo)志。 EColR I 酶切位點(diǎn)位于 Tetr 基因外部，外源基因插入不會(huì)引起篩選基因失活，因此無法區(qū)別重組體和野生型質(zhì)粒。 天然質(zhì)粒 ColE1質(zhì)粒，長(zhǎng)度為 kb， 唯一的 EcoRI酶切位點(diǎn)位于篩選標(biāo)志基因大腸桿菌素 E1（ colicin E1）內(nèi)部。 colicin E1能殺死不含 ColE1 質(zhì)粒的菌，形成“噬菌斑”?？梢酝ㄟ^插入失活篩選。但細(xì)菌群體容易自發(fā)突變出抗 colicin E1的細(xì)胞。 ?質(zhì)粒載體的發(fā)展概況 第一階段（ 1977年前）：天然質(zhì)粒和重組質(zhì)粒的利用，如 pSC101, colE1, pCR, pBR313和 pBR322。 第二階段：增大載體容量 (降低載體長(zhǎng)度 )，建立多克隆位點(diǎn)區(qū)和新的遺傳標(biāo)記基因 ,如pUC系列載體。 第三階段：完善載體功能以滿足基因工程克隆中的不同要求，如 M13mp系列載體，含 T3，T7， sp6啟動(dòng)子載體，表達(dá)型載體及各種探針型載體。 理想質(zhì)粒載體必須具備的基本條件： ?具有復(fù)制起點(diǎn)（ ORI） ? 具有抗菌素抗性基因：是篩選的標(biāo)志。理想的載體應(yīng)該有兩種抗菌素抗性基因。 ? 若干限制性內(nèi)切酶的單一位點(diǎn)：用來插入外源 DNA片斷。且插入后不影響復(fù)制功能。 ?具有較小的分子量和較高的拷貝數(shù)。 質(zhì)粒的選擇標(biāo)記及其工作原理： ?抗菌素抗性 絕大多數(shù)質(zhì)粒載體都是用抗菌素抗性標(biāo)記 . 氨芐青霉素抗性（ Ampr） :青霉素的衍生物。氨芐青霉素通過干擾細(xì)菌細(xì)胞壁合成的末端反應(yīng)，殺死生長(zhǎng)的細(xì)菌。 Ampr基因編碼 ?內(nèi)酰胺酶，特異地切割氨芐青霉素的 ?內(nèi)酰胺環(huán)。 卡那霉素抗性（ Kanr） :卡那霉素通過與 70S核糖體結(jié)合，導(dǎo)致 mRNA發(fā)生錯(cuò)讀，從而殺死細(xì)菌。 Kanr 編碼的氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶，對(duì)卡那霉素進(jìn)行修飾，阻斷其與核糖體結(jié)合作用。 四環(huán)素抗性（ Tetr） :四環(huán)素通過于 30S核糖體亞基結(jié)合，干擾細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成并阻止肽鍵的形成。殺死生長(zhǎng)的細(xì)菌。 Tetr 編碼特異性蛋白質(zhì)，對(duì)細(xì)菌的膜結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾，組止四環(huán)素通過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)。 鏈霉素抗性（ Strr） :鏈霉素通過與 30S核糖體亞基結(jié)合，導(dǎo)致 mRNA錯(cuò)譯，從而殺死細(xì)菌。 Strr 編碼一種氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶對(duì)鏈霉素進(jìn)行修飾，阻斷其與核糖體 30S亞基結(jié)合作用。 氯霉素抗性（ Cmlr） :氯霉素通過與 50S核糖體亞基結(jié)合，干擾細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成并阻止肽鍵的形成。殺死生長(zhǎng)的細(xì)菌。 Cmlr 編碼乙酰轉(zhuǎn)移酶，特異地使氯霉素乙酰化而失活。 人工構(gòu)建的質(zhì)粒載體的類型 ?高拷貝數(shù)的質(zhì)粒載體 pColE pMB1派生質(zhì)粒具有高拷貝數(shù)的特點(diǎn)。在沒有菌體蛋白質(zhì)合成的條件下（蛋白質(zhì)合成抑制劑，氯霉素等存在下）仍能復(fù)制，達(dá)到每個(gè)細(xì)胞的拷貝數(shù)1000— 3000個(gè)。適合大量增殖克隆基因、或需要表達(dá)大量的基因產(chǎn)物。 ?低拷貝數(shù)的質(zhì)粒載體 由 pSC101派生來的載體特點(diǎn)是分子量小，拷貝數(shù)低，不適合大量擴(kuò)增 DNA用。但當(dāng)有些被克隆的基因的表達(dá)產(chǎn)物過多時(shí)會(huì)嚴(yán)重地影響寄主菌的正常代謝活動(dòng)，導(dǎo)致寄主菌死亡時(shí)，就需要低拷貝的載體。如 pLG33 pLG33 pHSG415等。 ?失控的質(zhì)粒載體 溫度敏感型復(fù)制控制質(zhì)粒，溫度低于 37度 ，拷貝數(shù)很少； 溫度增加，大于 40度時(shí)，拷貝數(shù)會(huì)很快增加到 1000個(gè)以上。 B. E. Uhlin于 1979年構(gòu)建的載體如 pBEUpBEU2等。 ? 插入失活型質(zhì)粒載體 載體的克隆位點(diǎn)位于其某一個(gè)選擇性標(biāo)記基因內(nèi)部。如 pDF4 pDF4 pBR329。 ? 正選擇的質(zhì)粒載體 直接選擇轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞。只有帶有選擇標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)化菌細(xì)胞才能在選擇培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。如 pUR pTR262等。目前通用的絕大部分質(zhì)粒載體都是正選擇載體。 ? 表達(dá)型質(zhì)粒載體 主要用來使外源基因表達(dá)出蛋白質(zhì)產(chǎn)物。注意啟動(dòng)子的性質(zhì)，終止子、起始密碼、終止密碼的閱讀正確。如果在大腸桿菌里表達(dá)，必須把所克隆的真核生物的基因置于大腸桿菌的轉(zhuǎn)錄 — 翻譯信號(hào)控制之下 。 ? 克隆質(zhì)粒載體 專用于基因和 DNA片段無性繁殖的質(zhì)粒載體。純粹的獲取基因和 DNA片段。 常用的質(zhì)粒載體 pBR322 元件來源 復(fù)制起點(diǎn) ori pMB1系列（來源于 ColE1）的高拷貝型復(fù)制起點(diǎn) Ampr基因 pSP2124質(zhì)粒的 Ampr基因 Tetr基因 pSC101的 Tetr 基因。 長(zhǎng)度 4363bp 選擇標(biāo)記 氨芐青霉素和四環(huán)素抗性 克隆位點(diǎn) 24個(gè)克隆位點(diǎn)， 其中 9個(gè)會(huì)導(dǎo)致 Tetr基因失活（如 BamH I、 Hind Ⅲ 、 Sal I）； 3個(gè)會(huì)導(dǎo)致 Ampr基因失活（ Sca I、 PvuI、 Pst I）。 利用抗生素抗性基因篩選重組子的過程 BamHI片段 (Tcr) pBR322 PstI(Apr)片段 重組分子 Ⅱ (Aps Tcr) PstI片段 外源 DNA BamHI片段 重組分子 I (Apr Tcs） 分別轉(zhuǎn)化 (ApS TcS) 重組分子 Ⅱ (Aps Tcr) 影印到 Tc平板上 Apr Tcr為原載體 即為非重組子 影印到 Ap平板上 重組分子 I (Apr Tcs） 涂布 Ap平板 Apr轉(zhuǎn)化子 涂布 Tc平板 Tcr轉(zhuǎn)化子 Apr TcS為重組子 ApS Tcr為重組子 重組D N AA m prTcs提取D N A 電泳A m prA m prA m prA m prTcrTcrTcA m prTcsTcs轉(zhuǎn)化 無菌落陽(yáng)性菌落篩選重組子2 ) D N A 重組無D N A 插入有D N A 插入外源D N A1 ) 限制酶切影印 pBR322的優(yōu)點(diǎn) 雙抗菌素抗性選擇標(biāo)記 沒有獲得載體的寄主細(xì)胞 ?在 Amp或 Tet中都死亡。獲得載體的寄主細(xì)胞 ?在Amp或 Tet其中之一中死亡。 分子小，克隆能力大 載體越小越好。 10kb的 DNA在純化過程中容易斷裂。 高拷貝數(shù) 氯霉素?cái)U(kuò)增之后，每個(gè)細(xì)胞可達(dá) 1000~3000copy。 安全 失去了轉(zhuǎn)移蛋白基因 mob（ mobilization）。不能通過接合轉(zhuǎn)移。 pBR322的缺點(diǎn) 保留了轉(zhuǎn)移蛋白（ mob）的作用位點(diǎn)。能夠被 pColK質(zhì)粒編碼的 mob蛋白識(shí)別，如果再有 F質(zhì)粒的參與，就有可能轉(zhuǎn)移！ pBR322的改良 ? 刪除 mob識(shí)別位點(diǎn) 如 pAT153， pBR322的改造衍生質(zhì)粒 ，除去了 mob識(shí)別位點(diǎn)，同時(shí)增加質(zhì)粒的拷貝數(shù)。 ? 改造 EcoR I 位點(diǎn) 如 pBR325， 使 EcoRI 也成為插入失活型位點(diǎn)。在 pBR322位點(diǎn)上接入一段來自噬菌體 PICm的 HaeII酶切片斷（帶有氯霉素抗性基因 cmlr）。 cmlr上也帶一個(gè)EcoRI位點(diǎn)。 cmlr 常用的質(zhì)粒載體 pUC系列 University of California的 J. Messing和 J. Vieria于 1978年，在 pBR322的基礎(chǔ)上改造而成。屬正選擇載體。如 pUC pUC pUC pUC pUC1 pUC1 pUC19。 元件來源 復(fù)制起點(diǎn) oripBR322的 ori Ampr 基因 pBR322的 Ampr基因 大腸桿菌 β 半乳糖基因（ lacZ’ 基因） 多克隆位點(diǎn)（ MCS）區(qū)段 位于 lacZ’ 基因中的靠近 5`端。 長(zhǎng)度 約 克隆位點(diǎn) 10個(gè)連續(xù)的單一限制酶切位點(diǎn)