基因工程載體xxxx(已修改)
2025-01-15 18:08 本頁面
【正文】 第四章 基因工程載體 167。 1 概述 167。 2 克隆載體 167。 3 大腸桿菌表達 載體 第一節(jié) 概述 載體（ vector）是指將外源 DNA或基因攜帶進入宿主細胞進行擴增或表達的工具。 按功能 :克隆載體和表達載體，表達載體又分胞內(nèi)表達和分泌表達載體。 克隆載體（ cloning vector）：主要是對目的基因克隆，建立 DNA文庫和 cDNA文庫，其上有復制子即可； 表達載體（ expression vector）：能使目的基因在宿主細胞中表達的一類載體。這類載體既有復制子，更要有強啟動子； 按工作方式 :質(zhì)粒載體、噬菌體載體、粘粒載體、人工染色體載體等。 按受體細胞 :原核細胞載體和真核細胞載體。 第二節(jié) 克隆載體 克隆載體 (cloning vector)： 是指用于擴增或保存外源 DNA片段而設計的載體。 克隆載體的結(jié)構(gòu)特征 多克隆位點 (multiple cloning site) ori 復制起始點 遺傳標記 pUC MCS Ampr 克隆載體具備的條件 ① 載體都能攜帶外源 DNA片段 (基因 )進入受體細胞，或停留在細胞質(zhì)中自我復制，或整合到染色體 DNA上，隨著染色體 DNA的復制而同步復制 。 ② 載體都具有供外源基因插入的限制性核酸內(nèi)切酶位點，即多克隆位點 。 ③ 載體都具有合適的遺傳標記基因 。 ④ 載體都必須是安全的，不應含有對受體細胞有害的基因，并且不會任意轉(zhuǎn)入除受體細胞以外的其他生物細胞，尤其是人的細胞。 ⑤ 載體本身的分子量都比較小，可容納較大的外源基因片段。 ⑥ 載體在細胞內(nèi)的拷貝數(shù)要高，方便外源基因在細胞內(nèi)大量擴增。 ⑦ 載體在細胞內(nèi)穩(wěn)定性要高，保證重組體穩(wěn)定傳代而不易丟失。 ⑧ 載體的特征都是充分掌握的，包括它的全部核苷酸序列。 一、質(zhì)粒載體 質(zhì)粒載體是以質(zhì)粒 DNA分子為基礎(chǔ)構(gòu)建而成的克隆載體 ,主要用于原核生物和動植物的基因轉(zhuǎn)移以及建立基因文庫和 cDNA文庫。 (plasmid )的概念： 獨立于染色體外能夠進行自我復制的雙鏈 DNA分子。 天然 DNA質(zhì)粒具有 3種構(gòu)型： 共價閉合環(huán)狀 (cccDNA)、開環(huán) (ocDNA)和線性 (lDNA)構(gòu)型。 Plasmid chromosome ccc (1)質(zhì)粒 DNA分子可以持續(xù)穩(wěn)定地處于染色體外地游離狀態(tài) ,但在一定地條件下又會可逆地整合到寄主染色體上 ,隨著染色體地復制而復制 。 (2)質(zhì)粒 DNA在添加真核復制信號和啟動子后 ,可以構(gòu)建出能在原核和真核細胞中均可復制的穿梭質(zhì)粒，并在真核細胞中表達，因此這類載體在基因工程中應用廣泛。 (3)質(zhì)粒的拷貝數(shù) :是指每個宿主細胞內(nèi)質(zhì)粒的數(shù)量。根據(jù)每個宿主細胞中質(zhì)?？截悢?shù)的多少，把質(zhì)粒分為嚴緊型復制質(zhì)粒 (拷貝數(shù)少，為 15個 )與松弛型復制質(zhì)粒 (拷貝數(shù)多，可達10200個拷貝 )。因此，作為載體的質(zhì)粒應該是松弛型的。 (4)質(zhì)粒的不相容性 (inpatibility,又稱質(zhì)粒的不親和性 )： 兩種不同質(zhì)粒，不能夠在同一個寄主細胞系中穩(wěn)定共存的現(xiàn)象。 (親緣關(guān)系密切的 ,野生型和其衍生質(zhì)粒。 ) 第一階段（ 1977年前）：天然質(zhì)粒和重組質(zhì)粒的利用，如 pSC101, colE1, pCR, pBR313和 pBR322。 第二階段：增大載體容量 (降低載體長度 )，建立多克隆位點區(qū)和新的遺傳標記基因 ,如 pUC系列載體。 第三階段：完善載體功能以滿足基因工程克隆中的不同要求，如 M13mp系列載體，含 T3， T7， sp6啟動子載體，表達型載體及各種探針型載體。 標記基因按其用途分為 2類： 選擇標記基因 :用于鑒別目的載體的存在，將成功轉(zhuǎn)化了載體的宿主挑選出來。 篩選標記基因 :用于區(qū)別重組質(zhì)粒與非重組質(zhì)粒，可將攜帶了外源 DNA片段的重組質(zhì)粒挑選出來。 選擇標記基因 篩選標記基因 (1)α互補 (αplementation) 是指 β半乳糖苷酶基因 (LacZ)上缺失近操縱基因區(qū)段的突變體與帶有完整的近操縱基因區(qū)段的 LacZ基因的突變體之間實現(xiàn)互補，從而產(chǎn)生具有 β半乳糖苷酶學活性的蛋白，這種現(xiàn)象就稱為 α互補。 (2)插入失活 (insertional inactivation) 在質(zhì)粒 pBR322的抗四環(huán)素基因上插入一個外源基因后 ， 導致抗四環(huán)素基因失活 ， 變成只對氨芐青霉素有抗性 ， 這樣就可通過對抗生素是 雙抗 還是 單抗 來篩選是否有外源基因片段插入到載體中 ，這種篩選方法稱為插入失活 。 抗藥性標記選擇(插入失活法) 5 常用質(zhì)?？寺≥d體 pSC101質(zhì)粒載體 一種嚴謹型復制
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