基因工程第五章-載體(編輯修改稿)
2024-10-08 20:52 本頁(yè)面
【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 到另一離心管中，上清中是質(zhì)粒 DNA。 加等體積氯仿，振蕩混勻， 4℃ 12022rpm離心 10分種，將上清轉(zhuǎn)移到另一離心管中。用 2倍體積的無(wú)水乙醇沉淀雙鏈DNA。溫和振蕩混勻，于 18℃ 放置 20分鐘。用微量離心機(jī)于 4℃ 以 12022rpm離心 10分鐘。棄上清，加入 70%冷乙醇洗沉淀 12次真空干燥 DNA沉淀后，將其溶于 TE溶液中。 ： ? 寄主自身的遺傳背景： ? 質(zhì)粒一般都保藏在質(zhì)粒中，所以質(zhì)粒的穩(wěn)定性直接與寄主的特性有關(guān)，我們?cè)诨蚬こ讨胁捎玫募闹骷?xì)胞都是經(jīng)過(guò)人為改造過(guò)得微生物，如 JM110，JM10 XL1Blue等，這些菌株的 end基因均發(fā)生了突變， end基因負(fù)責(zé)編碼核酸內(nèi)切酶 I，突變后，菌株就失去了編碼能力，從而保證了質(zhì)粒在宿主細(xì)胞中穩(wěn)定存在。 ? 所以，我們要想獲得大量的質(zhì)粒 DNA，最好不要選擇野生型菌株作為宿主細(xì)胞。 ? 質(zhì)粒的拷貝數(shù)：分子的多與寡是決定產(chǎn)量的重要因素。 pBR322 拷貝數(shù)大于 25個(gè) 產(chǎn)量 ColE1 15個(gè) ug/ml 基因克隆盡量選擇松弛型質(zhì)粒，如果是嚴(yán)緊型要進(jìn)行質(zhì)粒復(fù)制子改造。 ? 質(zhì)粒的大?。和ǔＹ|(zhì)粒越大，拷貝數(shù)也越少，所以我們?cè)谶M(jìn)行基因重組時(shí)，首先要選擇分子量小的質(zhì)粒，其次質(zhì)粒分子量大的要使外源基因的片斷長(zhǎng)度合適，不要過(guò)大。 三、質(zhì)粒載體的構(gòu)建 天然質(zhì)粒存在著不同程度的局限性，不能直接作為基因克隆的載體，必須進(jìn)行改造。便于轉(zhuǎn)化、篩選。 質(zhì)粒的構(gòu)建有三個(gè)方面： 1. 引入易于檢測(cè)的選擇性標(biāo)記，去掉質(zhì)粒的非必需序列： ? 最早使用的質(zhì)粒載體只有一個(gè)選擇性標(biāo)記：抗性基因（一個(gè)標(biāo)記有局限性：無(wú)法知道外源基因是不是轉(zhuǎn)化進(jìn)入宿主細(xì)胞，因?yàn)榭蛰d體也可使菌株產(chǎn)生抗性）。 第一個(gè)經(jīng)改造的認(rèn)為較完善的質(zhì)粒載體是pBR313, 他是松弛型載體，引入了兩個(gè)標(biāo)記基因 抗四環(huán)素基因 Tecr和抗青霉素基因 Ampr, 他的外源基因插入位點(diǎn)在兩個(gè)抗性基因中 ? 質(zhì)粒的序列含有必要區(qū)和非必要區(qū)。 必要區(qū)指的是與質(zhì)粒 DNA復(fù)制有關(guān)的基因，他們對(duì)質(zhì)粒的存活、復(fù)制極為重要。 非必要區(qū)里存在著影響細(xì)胞性狀的基因，編碼產(chǎn)生特殊的物質(zhì)，另外還有一部分質(zhì)粒片斷至今不知其功能。 必要和非必要區(qū)各自獨(dú)立，所以我們可以把非必要區(qū)去除，只留下必要區(qū)。 2. 調(diào)整質(zhì)粒載體的結(jié)構(gòu)，引入多克隆位點(diǎn)： 新型載體都引入了一個(gè)人工合成的由多種常用限制性?xún)?nèi)切酶單一識(shí)別位點(diǎn)組成的序列，叫多克隆位點(diǎn)（ multiple cloning site, MCS ） 。 3. 引入多種用途的輔助序列，構(gòu)建具有特化功能的載體： ? 構(gòu)建質(zhì)?？捎糜诮M織化學(xué)方法的鑒定： pUC18載體帶有一個(gè) Lac操縱子的 DNA區(qū)段，宿主細(xì)胞具有與之互補(bǔ)的基因，當(dāng)質(zhì)粒進(jìn)入宿主后，由于互補(bǔ)作用，而實(shí)現(xiàn) β－半乳糖苷酶的表達(dá)（誘導(dǎo)物與阻遏蛋白結(jié)合，阻遏蛋白與操作子脫離）。外源基因的插入會(huì)導(dǎo)致基因失活而檢查重組子。 啟動(dòng)子的可控性啟動(dòng)子的可控性PP乳糖啟動(dòng)子 Pl a c的可控性：乳糖啟動(dòng)子 P l a c 的可控性：OOPP OO高效轉(zhuǎn)錄高效轉(zhuǎn)錄阻遏蛋白阻遏蛋白誘導(dǎo)誘導(dǎo)乳糖
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