22基因工程載體-噬菌體載體xxxx09(編輯修改稿)
2025-03-13 22:28 本頁面
【文章內容簡介】 A簡稱 RFDNA；2. 不論是 RFDNA還是 ssDNA都能感染大腸桿菌；3. 單鏈 DNA噬菌體顆粒的大小，是受其 DNA的多制約的，不存在包裝限制 問題；4. 容易測定外源 DNA片斷的插入取向；5. 可產生含外源片斷的單鏈 DNA分子。 3. M13噬菌體 噬菌體正鏈復制 復制型DNA經 pII蛋白造缺口3′5′經 pII蛋白剪切釋出單鏈 DNA(正鏈 )進入下一循環(huán)5′ 3′ 3′5′滾環(huán)復制在細菌內的復制模式圖 M13噬菌體幾個重要特點 ：1. M13噬菌體 不溶解 宿主細胞，只是 降 低 宿主細胞的生長速度。2. M13噬菌體能以 單鏈 和 雙鏈 兩種方式存在，因此可以用 感染 (經包裝的單鏈 DNA)和 轉化 (雙鏈 DNA)。3. 克隆的外源基因片段不宜大于 1000bp。M13噬菌體載體? M13是一種含單鍵（ +） DNA（ ssDNA）的絲狀大腸桿菌噬菌體，其基因組大小為 。這類載體主要用來獲得大量的單鏈ＤＮＡ片段，這種單鏈ＤＮＡ片段在遺傳學研究中主要用來測定ＤＮＡ序列（ sanger雙脫氧法）、基因的定點突變研究、異源雙鏈 DNA的分析等。 M13噬菌體的特點?感染 Ecoli后，在宿主細胞內會形成雙鏈的復制型ＤＮＡ（ replication form DNA, RF DNA）?？梢韵筚|粒ＤＮＡ那樣在體外進行純化和操作。 ?成熟的噬菌體顆粒僅能感染 F+細胞，這是因為這種噬菌體的感染位點在性散毛上。但是無論是 RF DNA或 ss DNA都能轉染 F+或 F細胞。 ?噬菌體顆粒的大小是受其ＤＮＡ的大小制約的，這一點正好與 λ 噬菌體相反。所以 M13噬菌體并不存在包裝限制的問題。 M13單鏈DNA噬菌體的生命周期RF DNAPhage M13 replication in the host cell:+RNA pol DNA polIII177。RFNicked by gene 2 protein+ssRolling circle replication, then cut and ligateCoated with gene 5 protein Gene 5 protein is replaced by gene 8 protein ect. Linear M13 phagereleased from the cell.（二） M13載體的構建（ 1）克隆區(qū)域的選定① 基因間隔區(qū)（ intergenic region, IG區(qū)）J. Messing證明， IG區(qū)存在M13的 復制起點 ，但可以插入外源 DNA而不影響 M13噬菌體的活力。在 IG區(qū)內插入一個大腸桿菌的LacZ’ （ ?肽序列 )。 利用 ?肽序列中的三個單一酶切位點（ Bgl II、 Ava II 和 Pvu I）。(2)加入酶切位點① 在 IG區(qū)內加入單一內切酶位點第一個 M13載體： M13mp1：M13 RFBsuI不完全消化各種長度的線性片斷（其中應有只在IG上切開的線性全長 M13） lac基因的HindII片斷 (lacI、lacP、 lacO、 lacZ’）連接 M13mp1JM101宿主只有在 IG區(qū)插入 lacZ’才能存活并在 Xgal上出現(xiàn)互補的藍噬菌斑（三） M13系列載體的優(yōu)點系列載體的優(yōu)點1） 有 MCS，便于克隆不同的酶切片段2） Xgal顯色反應，可供直接選擇3）無包裝限制，克隆能力大4）可以克隆雙鏈 DNA分子中的每一條鏈子代 M13噬菌體中包含的是單鏈 +DNA。 （四） M13噬菌體用途： 1） DNA序列測定；2） 制備單鏈 DNA探針；3） 用于定點突變的研究。M13載體? 具有多克隆位點 (MCS)，方便克隆。許多 M13載體的多克隆位點與質粒載體 pUC序列的多克隆位點是相同的，在克隆位點選擇上更為方便。 ? 可以定向地克隆 DNA片段，克隆在 M13 RF DNA分子上的雙鏈 DNA片段，到了子代噬菌體便成了單鏈的形式
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