基因工程3載體中國藥科大學(xué)生物工程所有(編輯修改稿)
2025-02-04 16:34 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 四個(gè)組成部分： ①來自 pBR322質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)ori）； ②氨芐青霉素抗性基因 Ampr，但它的 DNA中核苷酸序列已發(fā)生了變化，不再含有原來的核酸內(nèi)切限制酶的識(shí)別位點(diǎn)； ③大腸桿菌 β半乳糖苷酶基因（ lacZ）的啟動(dòng)子及編碼 α肽鏈的 DNA序列，此結(jié)構(gòu)稱為 lacZ`基因； ④位于 lacZ’基因中的靠近 5`端的一段多克隆位點(diǎn)（ MCS）區(qū)段，但它并不破壞該基因的功能。 pUC18 / 19：正選擇標(biāo)記 lacZ’ 的顯色原理 pUC18/19 Plac lacZ’ MCS b半乳糖苷酶的 a肽段 a b OHHHOHHO HH O HCH 2 OHONClBr 5溴 4氯 3吲哚基 bD半乳糖苷 Xgal 5溴 4氯靛藍(lán)（藍(lán)色） 476bp片段含有 lacZ基因的 5’序列，表達(dá)半乳糖苷酶的 α 片段。 LacZ的上游包括乳糖操縱子上的啟動(dòng)子 Plac和操縱基因 O。 lacZ之內(nèi)有 M13的多功能連接器 —— 多克隆位點(diǎn)（ MCS） 。 B am H IpUC182 6 8 6 b pAprl acZ39。or iGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTT396 452E coR I S stI K pn I S m aI X ba I S alI P stI S ph I H indI II(2)pUC質(zhì)粒載體的優(yōu)點(diǎn) ① 具有更小的分子量 (2686bp)和更高的拷貝數(shù) (500～ 700) ② 適用于組織化學(xué)方法檢測重組體 ③具有多克隆位點(diǎn) MCS區(qū)段，可以更方便的插入外源基因 二、噬菌體載體和柯斯載體 (cosmid) 及單鏈 DNA噬菌體載體 (M13) (一 )λ噬菌體 DNA λ噬菌體的結(jié)構(gòu)和性質(zhì) λ 噬菌體為雙鏈 DNA病毒，宿主為 。 在宿主內(nèi)有溶菌和溶源兩種形式，在溶源方式中，噬菌體感染宿主后其 DNA整合到宿主染色體 DNA中，伴隨宿主染色體復(fù)制而復(fù)制。 λ 噬菌體 DNA是有 48502bp組成的線性雙螺旋分子，分子量 107dal。 迄今已定位的基因至少 61個(gè)，其中一半?yún)⑴c了噬菌體生命周期的活動(dòng)，我們稱這類基因?yàn)?λ 噬菌體的 “ 必要基因 ” ；另一部分基因，當(dāng)它們被外源基因取代后，并不影響噬菌體的生命功能，我們稱這類基因?yàn)?λ 噬菌體的 “ 非必要基因 ” 。這為其作為基因工程噬菌體載體的基礎(chǔ)。 野生型的 λ噬菌體 DNA兩端各具 12個(gè)核苷酸組成的粘性末端，可用來構(gòu)建柯斯質(zhì)粒（ cosmid）。 l 噬菌體生物學(xué)特性： 生物結(jié)構(gòu) 5’ TCCAGCGGCGGGG 3’ 3’ CCCGCCGCTGGA 5’ COS COS cos 頭部合成基因 尾部合成基因 溶菌控制基因 晚期控制基因 DNA合成控制 基因 阻遏基因 早期控制基因 阻遏基因 重組基因 刪除與整合基因 l DNA λ噬菌體 DNA克隆載體 野生型的 λDNA 不適宜作為克隆載體。因?yàn)棰牌浞肿恿枯^大，⑵常用的限制酶切點(diǎn)較多。如EcoRI切點(diǎn) 5個(gè)， HindⅢ 切點(diǎn) 7個(gè)，而這些切點(diǎn)大多位于溶菌周期生長所必須基因內(nèi)，容納不下比其更大的外源性 DNA片段，必須對(duì)其進(jìn)行改造。 改造方法： ① 將噬菌體感染到具有 EcoR I限制修飾體系的和不具有 EcoR I 限制修飾體系的兩種寄主細(xì)胞中循環(huán)生長，使 λDNA 的 EcoR I 位點(diǎn)發(fā)生修飾作用或產(chǎn)生點(diǎn)突變，使其一些 EcoR I 位點(diǎn)不能再被 EcoR I 切割。最終篩選獲得僅有 12個(gè)限制酶位點(diǎn)的 λDNA 。 ②將 λDNA 在體外用限制酶消化，再將未切割部分包裝并感染 。如野生型 λDNA 上有 7個(gè)HindⅢ 限制位點(diǎn)，從圖中可看出， 1 和2之間片段的缺失，可降解去兩個(gè) HindⅢ 位點(diǎn) 1和 2。 按此上方法，可構(gòu)建兩類 λ噬菌體派生載體 ① 取代型載體或替換型載體（ replacement vector）它具有成對(duì)的克隆位點(diǎn)，這兩個(gè)位點(diǎn)之間的 λDNA 區(qū)段可以被外源插入的 DNA片段所取代。如 λEMBL4 和Charon40。 (圖 512) ② 插入型載體（ insertion vectors） 只具有一個(gè)可供外源 DNA插入的克隆位點(diǎn)（也有一些具有兩個(gè)插入位點(diǎn)）。外源性 DNA克隆到插入型的
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