22基因工程載體-噬菌體載體xxxx09-文庫(kù)吧在線文庫(kù)
【正文】 噬菌體的結(jié)構(gòu)和其核酸類(lèi)型 ： 結(jié)構(gòu)： 無(wú)尾部結(jié)構(gòu)的二十面體型、 具尾部結(jié)構(gòu)的二十面體型、 線狀體型 核酸類(lèi)型：最常見(jiàn)的是雙鏈線性 DNA、 雙鏈環(huán)形 DNA、 單鏈環(huán)形 DNA、 單鏈線形 DNA、 單鏈 RNA。T4 Bacteriophage71. 噬菌體的生物學(xué)特性溶菌周期指噬菌體將 DNA注入寄主細(xì)胞后很快環(huán)化，然后進(jìn)行自我復(fù)制、蛋白衣殼合成和新噬菌體顆粒的組裝，最后使寄主細(xì)胞破裂而釋放出大量的子代噬菌體。λ 噬菌體 組成特點(diǎn) ： 雙鏈線狀 DNA分子， 全長(zhǎng) 50kb， 含 65個(gè)基因， 在其分子兩端各含有12個(gè)堿基的互補(bǔ)單鏈，是天然的粘性末端，被稱(chēng)為COS位點(diǎn)。換型噬菌體 λ 是使用最廣泛的載體。篩選標(biāo)記： 藍(lán)白斑 (LacZ)、 噬菌斑 等 。2. M13噬菌體能以 單鏈 和 雙鏈 兩種方式存在，因此可以用 感染 (經(jīng)包裝的單鏈 DNA)和 轉(zhuǎn)化 (雙鏈 DNA)。 ?噬菌體顆粒的大小是受其ＤＮＡ的大小制約的，這一點(diǎn)正好與 λ 噬菌體相反。M13載體? 具有多克隆位點(diǎn) (MCS)，方便克隆。噬菌粒載體（噬菌粒載體（ phagemid vectors））由 質(zhì)粒載體 與 單鏈?zhǔn)删w載體 的復(fù)制起點(diǎn)結(jié)合而成的新型載體系列。MCS的中部已經(jīng)切開(kāi)，各有一個(gè) 3’端突出的 T。（ 3） cosmid載體比較小，但能插入較大的外源片段，可克隆外源片段的長(zhǎng)度在 15~45 kb之間。但它不會(huì)產(chǎn)生子代噬菌體，而是以質(zhì)粒 DNA的形式存在于細(xì)胞內(nèi)?，F(xiàn)雖建立了高密度菌落篩選法，但由于柯斯質(zhì)粒制成的基因文庫(kù)常常不太穩(wěn)定，插入的大片段外源 DNA有可能通過(guò)同宿主基因組交換而致丟失等，所以最常使用的還是噬菌體載體。因此，插入柯斯質(zhì)粒的外源 DNA可大于 40kb。3. 粘粒進(jìn)入細(xì)菌后則完全失去 噬菌體 的功能，而表現(xiàn) 質(zhì)粒 的特性。 可見(jiàn)， cosmid是由質(zhì)粒和 ?噬菌體的cos位點(diǎn) 構(gòu)建而成。常用的噬菌粒載體 pUC118和 pUC119 1. 具有較小分子量的共價(jià)、閉合、環(huán)形的基因組 DNA，可克隆 10kb的外源 DNA片段，并易于進(jìn)行分離與操作； 2. 編碼一個(gè) ampr基因作為選擇記號(hào)，因此只有攜帶pUC118或 pUC119噬菌粒載體的大腸桿菌轉(zhuǎn)化子細(xì)胞，才能夠在含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，便于轉(zhuǎn)化子的選擇； 3. 拷貝數(shù)含量高，每個(gè)寄主可高達(dá) 500個(gè)，所以只要用少量的大腸桿菌細(xì)胞培養(yǎng)物，便可制備出大量的載體DNA； 4. 存在著一個(gè)多克隆位點(diǎn)區(qū)，因此許多種不同類(lèi)型的外源 DNA片段，不經(jīng)修飾便可直接插入到載體分子上；5. 由于多克隆位點(diǎn)區(qū)阻斷了大腸桿菌 lacZ基因的5’ 端編碼區(qū)，可按照 IPTG組織化學(xué)顯色反應(yīng)試驗(yàn)，篩選重組子；6. lacZ基因是置于 lac啟動(dòng)子的控制之下，這樣插入的外源基因便會(huì)以融合蛋白質(zhì)的形式表達(dá)；7. 含有質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)，在沒(méi)有輔助噬菌體的情況下，克隆的外源基因可以像質(zhì)粒一樣按常規(guī)的方式，復(fù)制形成大量的雙鏈 DNA分子8. 帶有一個(gè) M13噬菌體的復(fù)制起點(diǎn)，在有輔助噬菌體感染的寄主細(xì)胞中，可以合成出單 DNA拷貝，并包裝成噬菌體顆分泌到培養(yǎng)基中；9. 在 pUC118和 pUC119這兩個(gè)載體中，多克隆位點(diǎn)區(qū)的核苷酸序列取向是彼此相反的，于是它們當(dāng)中的一個(gè)可轉(zhuǎn)錄克隆基因的正鏈 DNA，另一個(gè)則可轉(zhuǎn)錄出負(fù)鏈 DNA；10. 可以直接對(duì)克隆的 DNA片斷進(jìn)行核苷酸的序列測(cè)定，免去了從質(zhì)粒載體到噬菌體的這一煩瑣的亞克隆步驟。根據(jù) M13的生物學(xué)特性知道，M13子代噬菌體中總是只含有（＋）鏈，所以 M13載體克隆的外源 DNA片段在子代噬菌體中究竟是含有DNA分子中的哪條鏈，則完全取決于外源ＤＮＡ克隆時(shí)的取向。在 IG區(qū)內(nèi)插入一個(gè)大腸桿菌的LacZ’ （ ?肽序列 )。 M13噬菌體的特點(diǎn)
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