22基因工程載體-噬菌體載體xxxx09-資料下載頁(yè)
2025-02-23 22:28本頁(yè)面
【正文】 cos基因?？滤官|(zhì)粒能被包裝到 λ噬菌體粒子中，感染大腸桿菌；它攜帶入宿主細(xì)菌的 DNA片段（超過(guò) 45kb）要比質(zhì)粒載體攜帶的要大（一）粘粒 (cosmid) 組成：2. 抗性基因；1. 質(zhì)粒復(fù)制的起始位點(diǎn) (ORI)；3. 用于插入目的基因的單個(gè)酶切位點(diǎn)；4. ?噬菌體的 cos位點(diǎn) 。 可見(jiàn)， cosmid是由質(zhì)粒和 ?噬菌體的cos位點(diǎn) 構(gòu)建而成。與噬菌體載體和質(zhì)粒載體相比具有多個(gè)優(yōu)點(diǎn)：216。（ 1）具有 cos位點(diǎn)，能高效地轉(zhuǎn)化大腸桿菌，能在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)自身環(huán)化，并能在大腸桿菌中復(fù)制；216。（ 2）有像質(zhì)粒一樣的選擇標(biāo)記；216。（ 3） cosmid載體比較小，但能插入較大的外源片段，可克隆外源片段的長(zhǎng)度在 15~45 kb之間。由于 cosmid載體的大片段克隆能力，多用于基因組文庫(kù)的構(gòu)建，而 λ噬菌體載體多用于 cDNA文庫(kù)的構(gòu)建。已有多種粘粒載體可用于基因克隆， pJB8是最常用的粘粒載體之一1.（ 4) 多種單一酶切位點(diǎn)，便于克隆 粘粒載體的優(yōu)點(diǎn)柯斯質(zhì)粒載體的特點(diǎn)1. 具有 λ噬菌體的特性；2. 具有質(zhì)粒載體的特性；3. 具有較高容量的克隆能力；4. 具有與同源性序列的質(zhì)粒進(jìn)行重組的能力 特點(diǎn)：1. 可插入長(zhǎng)達(dá) 27～ 41kb的外源基因，方便地用于 克隆大片段 DNA。2. 加入 ?噬菌體 頭部和尾部蛋白，可將 粘粒包裝成類似于 ?噬菌體 的具感染能力的顆粒，方便地進(jìn)入大腸桿菌。3. 粘粒進(jìn)入細(xì)菌后則完全失去 噬菌體 的功能，而表現(xiàn) 質(zhì)粒 的特性?？滤官|(zhì)粒載體cosmid載體 ：也稱粘粒、柯斯載體。這是一類用于克隆大片段 DNA的載體，它是由 λ 噬菌體的cos（ cohesive）末端及質(zhì)粒（ plasmid）重組而成的載體。 cosmid載體帶有質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)、克隆位點(diǎn)、選擇性標(biāo)記以及 λ 噬菌體用于包裝的cos末端等，因此該載體在體外重組后，可利用噬菌體體外包裝的特性進(jìn)行體外包裝，利用噬菌體感染的方式將重組 DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞。但它不會(huì)產(chǎn)生子代噬菌體，而是以質(zhì)粒 DNA的形式存在于細(xì)胞內(nèi)?？滤官|(zhì)粒pHC79系由質(zhì)粒 pBR322和噬菌體 λ 的cos位點(diǎn)的一段 DNA構(gòu)成全長(zhǎng) 設(shè)計(jì)構(gòu)建的柯斯質(zhì)粒一般長(zhǎng) 4～ 6kb。其上的 cos位點(diǎn)的一個(gè)重要作用是識(shí)別噬菌體的外殼蛋白。凡具有 cos位點(diǎn)的任何DNA分子只要在長(zhǎng)度相當(dāng)于噬菌體基因組，就可以同外殼蛋白結(jié)合而被包裝成類似噬菌體 λ 的顆粒。因此，插入柯斯質(zhì)粒的外源 DNA可大于 40kb。重組的柯斯質(zhì)?？上笫删w λ 一樣感染大腸桿菌，并在細(xì)菌細(xì)胞中復(fù)制。DigestionLigationC) Packaging and infectFormation of a cosmid cloneLigation to cleaved cosmid vector molecules can produce vectortarget concatemers, resulting in a large exogenous DNA fragment flanked by cos sequences.采用柯斯質(zhì)粒作載體的困難① 載體自身只相當(dāng)于可以插入片段的 1/10左右，因此往往會(huì)出現(xiàn)載體同載體自身連接，結(jié)果在一個(gè)重組分子內(nèi)可有幾個(gè)柯斯質(zhì)粒載體連在一起。但用堿性磷酸酶處理，可阻止載體分子自身連接；② 大小不等的外源片段相互連接后插入同一個(gè)載體分子，結(jié)果使在基因組內(nèi)本來(lái)不是相鄰的片段錯(cuò)亂地連接成一個(gè)片段，會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析，后來(lái)專門(mén)選出 30～ 45kb的外源 DNA插入載體 DNA，此時(shí)，每個(gè)載體只可能插入一個(gè)外源片段，因?yàn)槿绻€(gè)片段，則將超過(guò)包裝成噬菌體顆粒的限度；③ 細(xì)菌的菌落體積遠(yuǎn)大于噬菌斑，因此如用柯斯質(zhì)粒制備基因文庫(kù)，則篩選所需的含某一 DNA片段的菌落很費(fèi)時(shí)間?，F(xiàn)雖建立了高密度菌落篩選法，但由于柯斯質(zhì)粒制成的基因文庫(kù)常常不太穩(wěn)定，插入的大片段外源 DNA有可能通過(guò)同宿主基因組交換而致丟失等，所以最常使用的還是噬菌體載體。OVer!!!!演講完畢，謝謝觀看！
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