基因工程載體-噬菌體載體(參考版)
2024-09-22 21:10本頁(yè)面
【正文】 現(xiàn)雖建立了高密度菌落篩選法，但由于柯斯質(zhì)粒制成的基因文庫(kù)常常不太穩(wěn)定，插入的大片段外源 DNA有可能通過同宿主基因組交換而致丟失等，所以最常使用的還是噬菌體載體。 Digestion Ligation C) Packaging and infect Formation of a cosmid clone Ligation to cleaved cosmid vector molecules can produce vectortarget concatemers, resulting in a large exogenous DNA fragment flanked by cos sequences. 采用柯斯質(zhì)粒作載體的困難 ① 載體自身只相當(dāng)于可以插入片段的 1/10左右，因此往往會(huì)出現(xiàn)載體同載體自身連接，結(jié)果在一個(gè)重組分子內(nèi)可有幾個(gè)柯斯質(zhì)粒載體連在一起。因此，插入柯斯質(zhì)粒的外源 DNA可大于 40kb。其上的 cos位點(diǎn)的一個(gè)重要作用是識(shí)別噬菌體的外殼蛋白。但它不會(huì)產(chǎn)生子代噬菌體，而是以質(zhì)粒 DNA的形式存在于細(xì)胞內(nèi)。這是一類用于克隆大片段 DNA的載體，它是由 λ 噬菌體的cos（ cohesive）末端及質(zhì)粒（ plasmid）重組而成的載體。 噬菌體 的功能，而表現(xiàn) 質(zhì)粒 的特性。已有多種粘粒載體可用于基因克隆， pJB8是最常用的粘粒載體之一 （ 4) 多種單一酶切位點(diǎn)，便于克隆 粘粒載體的優(yōu)點(diǎn) 柯斯質(zhì)粒載體的特點(diǎn) 1. 具有 λ噬菌體的特性； 2. 具有質(zhì)粒載體的特性； 3. 具有較高容量的克隆能力； 4. 具有與同源性序列的質(zhì)粒進(jìn)行重組的能力 特點(diǎn)： 27～ 41kb的外源基因，方便地用于 克隆大片段 DNA。 與噬菌體載體和質(zhì)粒載體相比具有多個(gè)優(yōu)點(diǎn)： ?（ 1）具有 cos位點(diǎn)，能高效地轉(zhuǎn)化大腸桿菌，能在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)自身環(huán)化，并能在大腸桿菌中復(fù)制； ?（ 2）有像質(zhì)粒一樣的選擇標(biāo)記； ?（ 3） cosmid載體比較小，但能插入較大的外源片段，可克隆外源片段的長(zhǎng)度在 15~45 kb之間。柯斯質(zhì)粒能被包裝到 λ噬菌體粒子中，感染大腸桿菌；它攜帶入宿主細(xì)菌的 DNA片段（超過 45kb）要比質(zhì)粒載體攜帶的要大 （一）粘粒 (cosmid) 組成： 2. 抗性基因； 1. 質(zhì)粒復(fù)制的起始位點(diǎn) (ORI)； 3. 用于插入目的基因的單個(gè)酶切位點(diǎn)； 4. ?噬菌體的 cos位點(diǎn) 。 ② 特點(diǎn) PCR產(chǎn)物往往在 3’端突出一個(gè) A，所以能與這個(gè)載體直接連接。 ① 結(jié)構(gòu) pUC的質(zhì)粒部分、 fi噬菌體 ori、 Kanr和Ampr抗性。 pBluescript噬菌粒載體 基本結(jié)構(gòu)： 1. 在多克隆位點(diǎn)的兩側(cè)，有一對(duì) T3和 T7噬菌體的啟動(dòng)子，可以定向指導(dǎo)外源基因的轉(zhuǎn)錄活動(dòng)； 2. 同時(shí)具有一個(gè)單鏈?zhǔn)删w M13或 f1的復(fù)制起點(diǎn)和一個(gè)來(lái)自 ColE1質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)，在不同的情況下，可以采取不同的復(fù)制形式，分別合成單鏈或雙鏈的 DNA； 3. 編碼有一個(gè)胺芐青霉素抗性基因，供作轉(zhuǎn)化子記號(hào)； lacZ基因，可用 XgalIPTG組織顯色反應(yīng)法篩選噬菌粒載體。 既能在大腸桿菌中以質(zhì)粒的形式雙鏈復(fù)制，又能在噬菌體內(nèi)進(jìn)行單鏈復(fù)制。 MCS 噬菌體 ori 質(zhì)粒 ori Ampr lacZ’ lacI 約 3000bp（比 M13?。? ② 克隆能力大 能插入 10kb的外源 DNA。 它具有質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)、選擇性標(biāo)記、多克隆位點(diǎn)等，方便 DNA的操作，可在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定存在；又具有單鏈?zhǔn)删w的復(fù)制起點(diǎn)，在輔助噬菌體的存在下，可進(jìn)行噬菌體的繁殖，產(chǎn)生單鏈的子代噬菌體。 這樣一來(lái) ， 為分別分離外源ＤＮＡ分子的兩條鏈帶來(lái)一定的麻煩 ， 解決這一問題的一個(gè)行之有效的方法就是定向克隆技術(shù) 。 所以如果要同時(shí)分離ＤＮＡ分子中的雙鏈 ， 則需要兩種獨(dú)立的克隆 。許多 M13載體的多克隆位點(diǎn)與質(zhì)粒載體 pUC序列的多克隆位點(diǎn)是相同的，在克隆位點(diǎn)選擇上更為方便。 （四） M13噬菌體用途 ： 1） DNA序列測(cè)定； 2） 制備單鏈 DNA探針； 3） 用于定點(diǎn)突變的研究。
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