22基因工程載體-噬菌體載體xxxx09(參考版)
2025-02-25 22:28本頁(yè)面
【正文】 OVer!!!!演講完畢，謝謝觀看！。但用堿性磷酸酶處理，可阻止載體分子自身連接；② 大小不等的外源片段相互連接后插入同一個(gè)載體分子，結(jié)果使在基因組內(nèi)本來(lái)不是相鄰的片段錯(cuò)亂地連接成一個(gè)片段，會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析，后來(lái)專門(mén)選出 30～ 45kb的外源 DNA插入載體 DNA，此時(shí)，每個(gè)載體只可能插入一個(gè)外源片段，因?yàn)槿绻€(gè)片段，則將超過(guò)包裝成噬菌體顆粒的限度；③ 細(xì)菌的菌落體積遠(yuǎn)大于噬菌斑，因此如用柯斯質(zhì)粒制備基因文庫(kù)，則篩選所需的含某一 DNA片段的菌落很費(fèi)時(shí)間。重組的柯斯質(zhì)粒可象噬菌體 λ 一樣感染大腸桿菌，并在細(xì)菌細(xì)胞中復(fù)制。凡具有 cos位點(diǎn)的任何DNA分子只要在長(zhǎng)度相當(dāng)于噬菌體基因組，就可以同外殼蛋白結(jié)合而被包裝成類似噬菌體 λ 的顆粒?？滤官|(zhì)粒pHC79系由質(zhì)粒 pBR322和噬菌體 λ 的cos位點(diǎn)的一段 DNA構(gòu)成全長(zhǎng) 設(shè)計(jì)構(gòu)建的柯斯質(zhì)粒一般長(zhǎng) 4～ 6kb。 cosmid載體帶有質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)、克隆位點(diǎn)、選擇性標(biāo)記以及 λ 噬菌體用于包裝的cos末端等，因此該載體在體外重組后，可利用噬菌體體外包裝的特性進(jìn)行體外包裝，利用噬菌體感染的方式將重組 DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞?？滤官|(zhì)粒載體cosmid載體 ：也稱粘粒、柯斯載體。2. 加入 ?噬菌體 頭部和尾部蛋白，可將 粘粒包裝成類似于 ?噬菌體 的具感染能力的顆粒，方便地進(jìn)入大腸桿菌。由于 cosmid載體的大片段克隆能力，多用于基因組文庫(kù)的構(gòu)建，而 λ噬菌體載體多用于 cDNA文庫(kù)的構(gòu)建。（ 2）有像質(zhì)粒一樣的選擇標(biāo)記；216。與噬菌體載體和質(zhì)粒載體相比具有多個(gè)優(yōu)點(diǎn)：216。柯斯質(zhì)粒能被包裝到 λ噬菌體粒子中，感染大腸桿菌；它攜帶入宿主細(xì)菌的 DNA片段（超過(guò) 45kb）要比質(zhì)粒載體攜帶的要大（一）粘粒 (cosmid) 組成：2. 抗性基因；1. 質(zhì)粒復(fù)制的起始位點(diǎn) (ORI)；3. 用于插入目的基因的單個(gè)酶切位點(diǎn)；4. ?噬菌體的 cos位點(diǎn) 。② 特點(diǎn)PCR產(chǎn)物往往在 3’ 端突出一個(gè) A，所以能與這個(gè)載體直接連接。① 結(jié)構(gòu)pUC的質(zhì)粒部分、 fi噬菌體 ori、 Kanr和Ampr抗性。pBluescript噬菌粒載體基本結(jié)構(gòu)： 1. 在多克隆位點(diǎn)的兩側(cè)，有一對(duì) T3和 T7噬菌體的啟動(dòng)子，可以定向指導(dǎo)外源基因的轉(zhuǎn)錄活動(dòng)； 2. 同時(shí)具有一個(gè)單鏈?zhǔn)删w M13或 f1的復(fù)制起點(diǎn)和一個(gè)來(lái)自 ColE1質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)，在不同的情況下，可以采取不同的復(fù)制形式，分別合成單鏈或雙鏈的 DNA； 3. 編碼有一個(gè)胺芐青霉素抗性基因，供作轉(zhuǎn)化子記號(hào)； lacZ基因，可用 XgalIPTG組織顯色反應(yīng)法篩選噬菌粒載體。既能在大腸桿菌中以質(zhì)粒的形式雙鏈復(fù)制，又能在噬菌體內(nèi)進(jìn)行單鏈復(fù)制。MCS噬菌體 ori質(zhì)粒 oriAmprlacZ’ lacI約 3000bp（比 M13小）② 克隆能力大能插入 10kb的外源 DNA。 它具有質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)、選擇性標(biāo)記、多克隆位點(diǎn)等，方便 DNA的操作，可在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定存在；又具有單鏈?zhǔn)删w的復(fù)制起點(diǎn)，在輔助噬菌體的存在下，可進(jìn)行噬菌體的繁殖，產(chǎn)生單鏈的子代噬菌體。這樣一來(lái)，為分別分離外源ＤＮＡ分子的兩條鏈帶來(lái)一定的麻煩，解決這一問(wèn)題的一個(gè)行之有效的方法就是定向克隆技術(shù)。所以如果要同時(shí)分離ＤＮＡ分子中的雙鏈，則需要兩種獨(dú)立的克隆。許多 M13載體的多克隆位點(diǎn)與質(zhì)粒載體 pUC序列的多克隆位點(diǎn)是相同的，在克隆位點(diǎn)選擇上更為方便。 （四） M13噬菌體用途： 1） DNA序列測(cè)定；2） 制備單鏈 DNA探針；3） 用于定點(diǎn)突變的研究。 利用 ?肽序列中的三個(gè)單一酶切位點(diǎn)（ Bgl II、 Ava II 和 Pvu I）。RFNicked by gene 2 protein+ssRolling circle replication, then cut and ligateCoated with gene 5 protein Gene 5 protein is replaced by g
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