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基因工程載體人工染色體載體(參考版)

2024-09-22 20:50本頁面
  

【正文】 對于穿梭載體,因?yàn)閺?fù)制起點(diǎn)和標(biāo)記基因具有生物特異性,所以載體上需要同時(shí)具有兩個(gè)以上的復(fù)制起點(diǎn)和標(biāo)記基因。如何解釋上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果 ? 可利用圖示法解釋。而從這兩類轉(zhuǎn)化細(xì)胞培養(yǎng)液所分離到的 DNA卻 ? 不能用限制酶回收該片段。從白色菌落中分離純化的質(zhì)粒經(jīng)電泳檢查,均比原載體 DNA分子大;但從蘭色菌落隨機(jī)分離的質(zhì)粒 DNA卻有兩類,其中一類與載體大小相同,另一類卻與白色菌落中分離的質(zhì)粒大小相同。 實(shí)驗(yàn)對象 如常用于基因工程的宿主菌 ,菌株不同,基因型亦不同,不同載體要求不同菌株。 分子克隆載體的選擇 選擇克隆載體的幾個(gè)重要參數(shù) ( 1)實(shí)驗(yàn)對象 ( 2)實(shí)驗(yàn)性質(zhì) ( 3)載體容量 ( 4)合適克隆位點(diǎn) ( 5)載體的穩(wěn)定性 ( 6)載體 DNA制備的難易 ( 7)外源基因表達(dá)產(chǎn)物產(chǎn)量、產(chǎn)物特點(diǎn)等 實(shí)驗(yàn)對象 ( 1)供體:遺傳背景與 DNA特點(diǎn)等,其中包括染色體 DNA大小,基因大小與結(jié)構(gòu),堿基組成,目的基因的產(chǎn)物特點(diǎn)以及遺傳物質(zhì)的傳遞方式等。這時(shí)把受感染的細(xì)胞同骨髓細(xì)胞一起培養(yǎng),包裝在輔助病毒外殼蛋白中的逆轉(zhuǎn)錄病毒 RNA,進(jìn)入骨髓細(xì)胞,病毒 DNA插入宿主細(xì)胞基因組,基因的活性得到表達(dá)。輔助病毒能合成蛋白外殼,但缺失了識別蛋白外殼進(jìn)行包裝的信號,因此它不能包裝成病毒顆粒。 Hock等選用了缺失編碼病毒外殼蛋白基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒,因此不能合成自身的外殼,但它有識別外殼蛋白進(jìn)行包裝的信號(一段尚未鑒定的 DNA順序)。 反轉(zhuǎn)錄病毒克隆載體 ? 反轉(zhuǎn)錄病毒是一類含 RNA的病毒,進(jìn)入受體細(xì)胞后, RNA反轉(zhuǎn)錄成 DNA,通過兩端由數(shù)百 bp組成的長末端重復(fù)序列,整合到染色體上,成為原病毒。有的逆轉(zhuǎn)錄病毒還帶有癌基因( vonc),即有的逆轉(zhuǎn)錄病毒有致癌作用。 Cloning vectors of animal cell ? 動(dòng)物病毒: 猿猴病毒 40(SV40)的衍生物 5243 bp共價(jià)閉合環(huán)狀分子 感染率高,幾乎 100%寄主細(xì)胞能被感染 能提供完整的真核基因轉(zhuǎn)錄所需的成分 侵染性具有寄主特異性 ? 改建: 野生型最多只能包裝其基因組長度的 DNA分子 ? 其他: 痘苗病毒 DNA作載體,表達(dá)乙肝表面抗原 用家蠶的核多角體病毒表達(dá)人 α 干擾素 SV40作為克隆載體有其局限性: ① SV40基因組的晚期功能區(qū)的裂解性,不利于外源 DNA的重組和表達(dá); ②早期功能區(qū)與病毒的致癌性有關(guān),使用時(shí)有顧慮; ③重組 DNA片段的大小受體限制。早已證明完整的小鼠染色體 β 珠蛋白基因(包括所有的間插順序和兩側(cè)順序)整合在 SV40中后,在被感染的猴腎細(xì)胞中都能正確地轉(zhuǎn)錄和翻譯。它在猴腎中增殖。 猴病毒 40( SV40)的基因組常用來作為克隆載體,把外源 DNA轉(zhuǎn)入哺乳類細(xì)胞。使載體及其攜帶的外來序列能方便地在細(xì)菌中繁殖和克隆,然后再引入真核細(xì)胞。感染動(dòng)物的病毒可改造用作動(dòng)物細(xì)胞的載體。構(gòu)建的含35S啟動(dòng)子的系列克隆載體可在植物細(xì)胞內(nèi)高效表達(dá)基因。該區(qū)中含有與農(nóng)桿堿合成有關(guān)的基因( ags)和生長素合成有關(guān)的基因( tms tms2)。該區(qū)中含有與毛狀根形成有關(guān)的 rolA、 B、 C、 D基因群。左右邊界上含有25bp的重復(fù)序列。 ?Ri質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)與 Ti質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)很相似,可以分為 T區(qū)、 vir區(qū)、 ori區(qū)和其它區(qū)域等幾個(gè)部分。 ?Ri質(zhì)粒也可完成外源基因向植物的轉(zhuǎn)移工作。 ( 2)共整合載體( integrated vector) 共整合載體系統(tǒng)包括在 TDNA上的激素合成區(qū)經(jīng)過突變后的 Ti質(zhì)粒和中間載體兩部分。這種整合是一種非正常重組。 ?在有關(guān)的植物細(xì)胞酶體系的催化作用下,合成互補(bǔ)鏈形成雙鏈形式的 TDNA分子。 ?Ti質(zhì)粒分子受到信號分子的激活作用之后,virD基因編碼的一種核酸內(nèi)切酶,先在 TDNA的 RB序列中的第 3和第 4堿基之間切開一個(gè) 單鏈 缺口,隨后在 TDNA同一條鏈的 LB序列中切出第二個(gè)單鏈缺口。 ( 3) Con區(qū) (region
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