【正文】 下午 12時(shí) 24分 33秒 下午 12時(shí) 24分 12:24: ? 楊柳散和風(fēng)，青山澹吾慮。 2023年 2月 下午 12時(shí) 24分 :24February 26, 2023 ? 1少年十五二十時(shí)，步行奪得胡馬騎。 2023年 2月 26日星期日 下午 12時(shí) 24分 33秒 12:24: ? 1楚塞三湘接，荊門九派通。 12:24:3312:24:3312:24Sunday, February 26, 2023 ? 1不知香積寺，數(shù)里入云峰。 12:24:3312:24:3312:242/26/2023 12:24:33 PM ? 1成功就是日復(fù)一日那一點(diǎn)點(diǎn)小小努力的積累。 下午 12時(shí) 24分 33秒 下午 12時(shí) 24分 12:24: ? 沒(méi)有失敗，只有暫時(shí)停止成功！。 2023年 2月 下午 12時(shí) 24分 :24February 26, 2023 ? 1行動(dòng)出成果，工作出財(cái)富。 2023年 2月 26日星期日 下午 12時(shí) 24分 33秒 12:24: ? 1比不了得就不比，得不到的就不要。 12:24:3312:24:3312:24Sunday, February 26, 2023 ? 1乍見(jiàn)翻疑夢(mèng)，相悲各問(wèn)年。 12:24:3312:24:3312:242/26/2023 12:24:33 PM ? 1以我獨(dú)沈久，愧君相見(jiàn)頻。 ? 靜夜四無(wú)鄰，荒居舊業(yè)貧。 兩類終止子有共同的序列特征。另一類則依賴蛋白輔因子才能實(shí)現(xiàn)終止作用。 ? 終止子位于 poly(A)位點(diǎn)下游，長(zhǎng)度在數(shù)百堿基以內(nèi)的結(jié)構(gòu)。 ? 終止子 (terminator T)是給予 RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)的 DNA序列。 CMV啟動(dòng)子（增強(qiáng)子）被廣泛應(yīng)用于構(gòu)建高效真核表達(dá)載體。 誘導(dǎo)型啟動(dòng)子 (inducible promoter)是指在某些特定的物理或化學(xué)信號(hào)的刺激下，該種類型的啟動(dòng)子可以大幅度地提高基因的轉(zhuǎn)錄水平。 啟動(dòng)子 啟動(dòng)子可分為 誘導(dǎo)型啟動(dòng)子 和 組成型啟動(dòng)子 兩大類，后者包括 CMV， SV40， T7, pMC1，PGK啟動(dòng)子等。 ? TATA框的主要作用是使轉(zhuǎn)錄精確地起始； CAAT框和 GC框則主要是控制轉(zhuǎn)錄起始的頻率，特別是 CAAT框?qū)D(zhuǎn)錄起始頻率的作用更大。端上游的 DNA序列，能活化 RNA聚合酶，使之與模板 DNA準(zhǔn)確的結(jié)合并具有轉(zhuǎn)錄起始的特異性。 iii. DH5αF’可供 M13mp系列載體配套使用， M13病毒的感染需要 F’的存在。 φ80dlacZ△ M15, △ (lacZYAargF)U169 E .coli DH5αF’: F’, endA1, hsdR17(rk–,mk+ ),supE44,thi–, λ–, recA1, relA1, gyrA96,φ80dlacZ△ M15, △ (lacZYAargF)U169 i. 三者均有重組基因缺陷，外源 DNA可存活，且不發(fā)生重組。 大腸桿菌基因型及遺傳符號(hào)說(shuō)明（ 12） ? DH5α? ： F–， φ80， lacZΔM15， Δ(lacZYAargF)U169， recA1， endA1，hsdR17 (rK–, mK+) ， phoA， supE44 ， gyrA96 ， relA1 課堂小練習(xí) F：缺失 F質(zhì)粒 . Φ80：宿主攜帶 λ噬菌體 φ 80. lacZ ΔM15：刪除編碼 β半乳糖苷酶的部分 lacZ基因 (α片斷的一段基因 ). Δ(lacZYAargF)U169： lacZYA表示 lacZ(β半乳糖苷酶 )、 lacY(透性酶 )、 lacA(乙?；D(zhuǎn)移梅 )， argF基因是精氨酸合成酶， U169表示三個(gè) lac基因和 argF基因之間缺失了 10000bp. hsdR17 (rK–, mK+) ： R17代表特異性識(shí)別蛋白發(fā)生變異， (rK–, mK+) 表示由于 R17的變異而導(dǎo)致 K12株來(lái)源的 hsdR 功能缺失 . phoA： 大腸桿菌堿性磷酸酶 . gyrA96 ：突變 DNA解旋酶 常用于基因工程的宿主菌 ，菌株不同，基因型亦不同，不同載體要求不同菌株。同時(shí) relA基因還表達(dá)ATP:GTP3`焦磷酸轉(zhuǎn)移酶，負(fù)責(zé)在氨基酸饑餓狀態(tài)下鳥(niǎo)苷 3` ,5`二磷酸 (ppGpp)的合成，以適應(yīng)饑餓環(huán)境。 deoR基因的變異，使 deo操縱子的阻遏蛋白不能表達(dá)，宿主細(xì)胞合成大量的 dCTP，可以選擇性地改善大分子 DNA的轉(zhuǎn)化。 ? 1其他 deoR(Deoxyribose)是大腸桿菌中 deo操縱子的調(diào)節(jié)基因，它表達(dá)的阻遏蛋白對(duì) deo操縱子具有重要的調(diào)控作用。 cysA(Cysteine)基因表達(dá)硫酸鹽 /硫代硫酸鹽轉(zhuǎn)移蛋白，參與細(xì)胞對(duì)硫酸鹽的吸收與轉(zhuǎn)運(yùn)，通過(guò) cysA蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)的硫酸鹽將參與半胱氨酸的生物合成。另外 tsx受體蛋白還有與核苷酸特異性結(jié)合的功能，是核苷酸特異性運(yùn)輸通道的第一步，在核苷酸的吸收方面也起重要作用。 tonA和 fhuA基因的變異使細(xì)胞對(duì)鐵離子的吸收受到阻害，同時(shí)使細(xì)胞對(duì)某些抗菌素及噬菌體更敏感，有利于質(zhì)粒轉(zhuǎn)化和菌體篩選。 大腸桿菌基因型及遺傳符號(hào)說(shuō)明（ 10） ? 1物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)合相關(guān)的基因型 tonA(Transport)和 fhuA(Ferric hydroxamateuptake)基因處于基因組圖同一位點(diǎn)，它們的作用也相同，都是表達(dá)外膜受體蛋白。 ompT(Outer membrane protein)表達(dá)特異性的外膜蛋白分解酶，它特異性地分解與細(xì)胞膜結(jié)合的含鐵腸菌素受體蛋白。 大腸桿菌基因型及遺傳符號(hào)說(shuō)明（ 9） ? 蛋白酶相關(guān)的基因型 lon(long form)表達(dá) ATP依賴型蛋白分解酶 (La)，它對(duì)外源的異型蛋白質(zhì)具有特異性的分解作用。 thiA表達(dá)硫氨素噻唑轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、 thiB表達(dá)硫氨素磷酸鹽焦磷酸化酶、 thiC表達(dá)硫氨素嘧啶轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、thiD表達(dá)磷酸甲基化嘧啶激酶、 thiK表達(dá)硫氨素激酶、 thiL表達(dá)硫氨素甲磷酸激酶。 bioH基因的變異使細(xì)胞不能自身合成生物素，在最小培養(yǎng)基中必須添加生物素，細(xì)胞才能正常生長(zhǎng)。 thr 基因的變異使細(xì)胞不能合成蘇氨酸，用最小培養(yǎng)基培養(yǎng)時(shí)需添加蘇氨酸。 thr(Thronine)包含 thrA、 thrB和 thrC三種基因。 proB(Proline)表達(dá)谷氨酸巖 5磷酸激酶，它能催化三磷酸鹽與谷氨酸鹽結(jié)合形成谷氨酸 5磷酸鹽，是脯氨酸合成的第一步。 proA(Proline)表達(dá) γ谷氨酸磷酸還原酶，作用于脯氨酸生物合成的第二步。 大腸桿菌基因型及遺傳符號(hào)說(shuō)明（ 7） ? 氨基酸代謝相關(guān)的基因型 thy A(Thymine）表達(dá)胸苷酸合成酶，參與胸腺嘧啶的代謝。 ara(Arabinose)表達(dá)阿拉伯糖代謝所需的各種酶，其中 araA表達(dá)阿拉伯糖異構(gòu)酶、 araB表達(dá)核酮糖激酶、 araC表達(dá)阻遏蛋白， araD表達(dá) L核酮糖 4磷酸差向異構(gòu)酶、 araE表達(dá)低親和型 L阿拉伯糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、 araF表達(dá) L阿拉伯糖結(jié)合蛋白、 araG表達(dá)高親和性的 L阿拉伯糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。 lacZ M15是表達(dá) β半乳糖苷酶 α片斷的一段基因，當(dāng)△ M15時(shí)， β半乳糖苷酶沒(méi)有活性。 大腸桿菌基因型及遺傳符號(hào)說(shuō)明（ 6） ? 能量代謝相關(guān)的基因型 lacZ(Lactose)是大腸桿菌中 lac操縱子的結(jié)構(gòu)基因，表達(dá) β半乳糖苷酶，分解乳糖為半乳糖苷。 Tn10(Transposon)是帶有四環(huán)素 (tetracycline)抗性基因的轉(zhuǎn)座子。 rpsL基因的變異使鏈霉素失去結(jié)合位點(diǎn)，從而使該基因型的菌株具有了對(duì)鏈霉素的抗性 (Strr)。 rpsL(Ribosomal protein small subunit)表達(dá)核糖體 30S亞基中的 S12蛋白質(zhì)， S12蛋白作用于翻譯的開(kāi)始階段。 大腸桿菌基因型及遺傳符號(hào)說(shuō)明（ 5） ? 抗藥性相關(guān)的基因型 gyrA(Gyrase)表達(dá) DNA促旋酶 A亞基。 mutT特異性地降解 dGTP成為單磷酸鹽狀態(tài)的 dGMP， DNA合成受到阻礙，防止 dGTP插入模板 DNA中導(dǎo)致 AT轉(zhuǎn)換成 GC,使 DNA產(chǎn)生變異。 supF基因變異時(shí)，不能表達(dá)正常的阻遏蛋白，遇到停止密碼子 UAG,蛋白質(zhì)合成仍能繼續(xù)，并使 UAG作為一個(gè)密碼子編碼酪氨酸 （ Tyrosine）。 supE基因變異時(shí)，不能表達(dá)正常的阻遏蛋白，遇到停止密碼子 UAG,蛋白質(zhì)合成仍能繼續(xù)，并使UAG作為一個(gè)密碼子編碼谷氨酰胺（ Glutamine）。 大腸桿菌基因型及遺傳符號(hào)說(shuō)明（ 3） ? 大腸桿菌宿主的限制和修飾系統(tǒng)（ hsdR、 hsdM和 hsdS） hsdS hsdR hsdM (1)hsdR (Host specificitive defective Restriction)? 限制性內(nèi)切酶 (EcoKI[K12株 ] 或 EcoBI[B株 ]) ? 識(shí)別特定位點(diǎn) (EcoKI識(shí)別 5‘...AAC(N)6GTGC序列， EcoBI識(shí)別5’...TGA(N)8TGCT序列 )并隨機(jī)切斷 DNA。 hsdS表達(dá)的特異性蛋白是 I型限制酶 EcoK或 EcoB復(fù)合體中的一部分，它專門負(fù)責(zé) hsdR酶和hsdM酶對(duì) DNA序列的特異識(shí)別。 hsdM表達(dá) DNA甲基化酶，該酶是 I型限制酶復(fù)合體 (具有對(duì) DNA切斷和修補(bǔ)的雙重功能 )的一部分，它能使 DNA雙鏈上的 AA(雙腺嘌呤 )甲基化，保護(hù)宿主 DNA不被分解。 大腸桿菌基因型及遺傳符號(hào)說(shuō)明（ 1） ? 甲基化相關(guān)的基因型 dam(DNA adenine methylase)表達(dá) DNA腺嘌呤甲基化酶，它能催化特異序列 GATC中 A的甲基化，保證 DNA免受限制性核酸內(nèi)切酶 MboI的切斷，同時(shí)在 DNA復(fù)制時(shí)也起一定的輔助作用。 DNase催化雙鏈 DNA的解旋和解鏈，核酸外切酶 V催化單鏈 DNA的 裂解，在 DNA的重組和損傷修復(fù)中發(fā)揮重要作用。 DelrecA說(shuō)明此菌株的表現(xiàn)型是重組缺陷的?；蛐停?recA1， endA1， gyrA96，thi－ 1， hsdR17， supE44， relA1， Δ（ lac－ proAB） /F’[traD36， proAB+， lacIq，lacZΔM15] ? TOP10菌株 適用于高效的 DNA克隆和質(zhì)粒擴(kuò)增，能保證高拷貝質(zhì)粒的穩(wěn)定遺傳。該菌適合表達(dá)非毒性蛋白?？捎糜谒{(lán)白斑篩選鑒別重組菌株。缺失 E3的重組腺病毒不需要輔助病毒。缺失 E1的重組腺病毒必須在已經(jīng)被腺病毒（輔助病毒）感染的細(xì)胞中繁殖?；虮磉_(dá)時(shí)間短。 （四）重組腺病毒 DNA在細(xì)胞中的生存 （ 1）以游離的附加體形式存在于細(xì)胞中。 （ 3）把質(zhì)粒切成線性 （ 4）共同轉(zhuǎn)染細(xì)胞。 （ 2）構(gòu)建質(zhì)粒載體。 （ 1）刪除腺病毒 DNA一些非必需區(qū)。 （三）腺病毒載體 目前最常用的基因治療載體之一。 （ 5）腺病毒容易制備、純化。 （ 3）可以在呼吸道和腸道中繁殖，可以通過(guò)口服或噴霧的方式感染。 （二）腺病毒的優(yōu)點(diǎn)： （ 1）比較安全，無(wú)致病、致癌、致畸作用。（反轉(zhuǎn)錄病毒一般只感染處在分裂狀態(tài)的細(xì)胞） DNA病毒載體 —腺病毒載體 （一）腺病毒的基因組：是線狀雙鏈 DNA病毒，基因組中有 14個(gè)基因。 （ 4）包裝的外源 DNA可達(dá) 10kb。 （ 2）侵染范圍廣、感染率高。轉(zhuǎn)入的載體 DNA上帶有 y+，轉(zhuǎn)錄成的載體 RNA就會(huì)被包裝細(xì)胞中原有的病毒外殼蛋白識(shí)別包裝成重組病毒顆粒。用兩個(gè)缺失了y+的反轉(zhuǎn)錄病毒染色體轉(zhuǎn)化細(xì)胞，以制造病毒外殼蛋白。 （ 2）插入標(biāo)記基因（如 neor） （ 3）外源基因和啟動(dòng)子插入到 y+下游。 ? gag：核心蛋白。 ? env：外殼蛋白。 ? U U3： 5’段或 3’端獨(dú)特序列。整合時(shí)，整合酶在 U5U3連接處切開(kāi)雙鏈 DNA，隨機(jī)插入到宿主基因組里。 ? LTR是長(zhǎng)末端重復(fù)序列。兩個(gè)相同的 RNA分子在 5’端附近經(jīng)氫鍵連接形成 70S RNA，這種結(jié)構(gòu)可能在逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程中起調(diào)節(jié)作用。目前病毒載體常用者有改造來(lái)自猴腎病毒 SV40（ Simian Virus 40）、逆轉(zhuǎn)錄病毒和昆蟲(chóng)桿狀病毒等，使用這些病毒載體的目的多為將目的基因或序列放入動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)或作基因治療等。由于動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)和操作較復(fù)雜、花費(fèi)也較多，因而病毒載體構(gòu)建時(shí)一般都把細(xì)菌質(zhì)粒復(fù)制起始序列放置其中。 載體類型 存在方式 所需 DNA序列 標(biāo)記基因 轉(zhuǎn)化頻率（菌 落 /μgDNA） 穩(wěn)定性 無(wú)絲分裂 有絲分裂 整合型 (YIp5) 整合 1幾個(gè)拷貝 與染色體 DNA同源 Apr Tcr URA3 10 +a +a 附加體型(YEp13) 自主復(fù)制多拷貝 2μ質(zhì)粒 Apr Tcr LEU2 103104 b c 復(fù)制型 (YRp7) 自主復(fù)制多拷貝 ARS Apr Tcr TRP1 103104 b c 著絲粒型(YCp19) 染色體狀通常單拷貝 ARS,CEN Apr TRP1,URA3 103104 +d +d 線型 (YLp21) 染色體狀通常單 拷貝 ARS