【正文】 下午 12時 24分 33秒 下午 12時 24分 12:24: ? 楊柳散和風，青山澹吾慮。 2023年 2月 下午 12時 24分 :24February 26, 2023 ? 1少年十五二十時，步行奪得胡馬騎。 2023年 2月 26日星期日 下午 12時 24分 33秒 12:24: ? 1楚塞三湘接，荊門九派通。 12:24:3312:24:3312:24Sunday, February 26, 2023 ? 1不知香積寺，數(shù)里入云峰。 12:24:3312:24:3312:242/26/2023 12:24:33 PM ? 1成功就是日復一日那一點點小小努力的積累。 下午 12時 24分 33秒 下午 12時 24分 12:24: ? 沒有失敗，只有暫時停止成功！。 2023年 2月 下午 12時 24分 :24February 26, 2023 ? 1行動出成果，工作出財富。 2023年 2月 26日星期日 下午 12時 24分 33秒 12:24: ? 1比不了得就不比，得不到的就不要。 12:24:3312:24:3312:24Sunday, February 26, 2023 ? 1乍見翻疑夢，相悲各問年。 12:24:3312:24:3312:242/26/2023 12:24:33 PM ? 1以我獨沈久，愧君相見頻。 ? 靜夜四無鄰，荒居舊業(yè)貧。 兩類終止子有共同的序列特征。另一類則依賴蛋白輔因子才能實現(xiàn)終止作用。 ? 終止子位于 poly(A)位點下游，長度在數(shù)百堿基以內的結構。 ? 終止子 (terminator T)是給予 RNA聚合酶轉錄終止信號的 DNA序列。 CMV啟動子（增強子）被廣泛應用于構建高效真核表達載體。 誘導型啟動子 (inducible promoter)是指在某些特定的物理或化學信號的刺激下，該種類型的啟動子可以大幅度地提高基因的轉錄水平。 啟動子 啟動子可分為 誘導型啟動子 和 組成型啟動子 兩大類，后者包括 CMV， SV40， T7, pMC1，PGK啟動子等。 ? TATA框的主要作用是使轉錄精確地起始； CAAT框和 GC框則主要是控制轉錄起始的頻率，特別是 CAAT框對轉錄起始頻率的作用更大。端上游的 DNA序列，能活化 RNA聚合酶，使之與模板 DNA準確的結合并具有轉錄起始的特異性。 iii. DH5αF’可供 M13mp系列載體配套使用， M13病毒的感染需要 F’的存在。 φ80dlacZ△ M15, △ (lacZYAargF)U169 E .coli DH5αF’: F’, endA1, hsdR17(rk–,mk+ ),supE44,thi–, λ–, recA1, relA1, gyrA96,φ80dlacZ△ M15, △ (lacZYAargF)U169 i. 三者均有重組基因缺陷，外源 DNA可存活，且不發(fā)生重組。 大腸桿菌基因型及遺傳符號說明（ 12） ? DH5α? ： F–， φ80， lacZΔM15， Δ(lacZYAargF)U169， recA1， endA1，hsdR17 (rK–, mK+) ， phoA， supE44 ， gyrA96 ， relA1 課堂小練習 F：缺失 F質粒 . Φ80：宿主攜帶 λ噬菌體 φ 80. lacZ ΔM15：刪除編碼 β半乳糖苷酶的部分 lacZ基因 (α片斷的一段基因 ). Δ(lacZYAargF)U169： lacZYA表示 lacZ(β半乳糖苷酶 )、 lacY(透性酶 )、 lacA(乙?；D移梅 )， argF基因是精氨酸合成酶， U169表示三個 lac基因和 argF基因之間缺失了 10000bp. hsdR17 (rK–, mK+) ： R17代表特異性識別蛋白發(fā)生變異， (rK–, mK+) 表示由于 R17的變異而導致 K12株來源的 hsdR 功能缺失 . phoA： 大腸桿菌堿性磷酸酶 . gyrA96 ：突變 DNA解旋酶 常用于基因工程的宿主菌 ，菌株不同，基因型亦不同，不同載體要求不同菌株。同時 relA基因還表達ATP:GTP3`焦磷酸轉移酶，負責在氨基酸饑餓狀態(tài)下鳥苷 3` ,5`二磷酸 (ppGpp)的合成，以適應饑餓環(huán)境。 deoR基因的變異，使 deo操縱子的阻遏蛋白不能表達，宿主細胞合成大量的 dCTP，可以選擇性地改善大分子 DNA的轉化。 ? 1其他 deoR(Deoxyribose)是大腸桿菌中 deo操縱子的調節(jié)基因，它表達的阻遏蛋白對 deo操縱子具有重要的調控作用。 cysA(Cysteine)基因表達硫酸鹽 /硫代硫酸鹽轉移蛋白，參與細胞對硫酸鹽的吸收與轉運，通過 cysA蛋白轉運的硫酸鹽將參與半胱氨酸的生物合成。另外 tsx受體蛋白還有與核苷酸特異性結合的功能，是核苷酸特異性運輸通道的第一步，在核苷酸的吸收方面也起重要作用。 tonA和 fhuA基因的變異使細胞對鐵離子的吸收受到阻害，同時使細胞對某些抗菌素及噬菌體更敏感，有利于質粒轉化和菌體篩選。 大腸桿菌基因型及遺傳符號說明（ 10） ? 1物質轉運結合相關的基因型 tonA(Transport)和 fhuA(Ferric hydroxamateuptake)基因處于基因組圖同一位點，它們的作用也相同，都是表達外膜受體蛋白。 ompT(Outer membrane protein)表達特異性的外膜蛋白分解酶，它特異性地分解與細胞膜結合的含鐵腸菌素受體蛋白。 大腸桿菌基因型及遺傳符號說明（ 9） ? 蛋白酶相關的基因型 lon(long form)表達 ATP依賴型蛋白分解酶 (La)，它對外源的異型蛋白質具有特異性的分解作用。 thiA表達硫氨素噻唑轉運蛋白、 thiB表達硫氨素磷酸鹽焦磷酸化酶、 thiC表達硫氨素嘧啶轉運蛋白、thiD表達磷酸甲基化嘧啶激酶、 thiK表達硫氨素激酶、 thiL表達硫氨素甲磷酸激酶。 bioH基因的變異使細胞不能自身合成生物素，在最小培養(yǎng)基中必須添加生物素，細胞才能正常生長。 thr 基因的變異使細胞不能合成蘇氨酸，用最小培養(yǎng)基培養(yǎng)時需添加蘇氨酸。 thr(Thronine)包含 thrA、 thrB和 thrC三種基因。 proB(Proline)表達谷氨酸巖 5磷酸激酶，它能催化三磷酸鹽與谷氨酸鹽結合形成谷氨酸 5磷酸鹽，是脯氨酸合成的第一步。 proA(Proline)表達 γ谷氨酸磷酸還原酶，作用于脯氨酸生物合成的第二步。 大腸桿菌基因型及遺傳符號說明（ 7） ? 氨基酸代謝相關的基因型 thy A(Thymine）表達胸苷酸合成酶，參與胸腺嘧啶的代謝。 ara(Arabinose)表達阿拉伯糖代謝所需的各種酶，其中 araA表達阿拉伯糖異構酶、 araB表達核酮糖激酶、 araC表達阻遏蛋白， araD表達 L核酮糖 4磷酸差向異構酶、 araE表達低親和型 L阿拉伯糖轉運蛋白、 araF表達 L阿拉伯糖結合蛋白、 araG表達高親和性的 L阿拉伯糖轉運蛋白。 lacZ M15是表達 β半乳糖苷酶 α片斷的一段基因，當△ M15時， β半乳糖苷酶沒有活性。 大腸桿菌基因型及遺傳符號說明（ 6） ? 能量代謝相關的基因型 lacZ(Lactose)是大腸桿菌中 lac操縱子的結構基因，表達 β半乳糖苷酶，分解乳糖為半乳糖苷。 Tn10(Transposon)是帶有四環(huán)素 (tetracycline)抗性基因的轉座子。 rpsL基因的變異使鏈霉素失去結合位點，從而使該基因型的菌株具有了對鏈霉素的抗性 (Strr)。 rpsL(Ribosomal protein small subunit)表達核糖體 30S亞基中的 S12蛋白質， S12蛋白作用于翻譯的開始階段。 大腸桿菌基因型及遺傳符號說明（ 5） ? 抗藥性相關的基因型 gyrA(Gyrase)表達 DNA促旋酶 A亞基。 mutT特異性地降解 dGTP成為單磷酸鹽狀態(tài)的 dGMP， DNA合成受到阻礙，防止 dGTP插入模板 DNA中導致 AT轉換成 GC,使 DNA產生變異。 supF基因變異時，不能表達正常的阻遏蛋白，遇到停止密碼子 UAG,蛋白質合成仍能繼續(xù)，并使 UAG作為一個密碼子編碼酪氨酸 （ Tyrosine）。 supE基因變異時，不能表達正常的阻遏蛋白，遇到停止密碼子 UAG,蛋白質合成仍能繼續(xù)，并使UAG作為一個密碼子編碼谷氨酰胺（ Glutamine）。 大腸桿菌基因型及遺傳符號說明（ 3） ? 大腸桿菌宿主的限制和修飾系統(tǒng)（ hsdR、 hsdM和 hsdS） hsdS hsdR hsdM (1)hsdR (Host specificitive defective Restriction)? 限制性內切酶 (EcoKI[K12株 ] 或 EcoBI[B株 ]) ? 識別特定位點 (EcoKI識別 5‘...AAC(N)6GTGC序列， EcoBI識別5’...TGA(N)8TGCT序列 )并隨機切斷 DNA。 hsdS表達的特異性蛋白是 I型限制酶 EcoK或 EcoB復合體中的一部分，它專門負責 hsdR酶和hsdM酶對 DNA序列的特異識別。 hsdM表達 DNA甲基化酶，該酶是 I型限制酶復合體 (具有對 DNA切斷和修補的雙重功能 )的一部分，它能使 DNA雙鏈上的 AA(雙腺嘌呤 )甲基化，保護宿主 DNA不被分解。 大腸桿菌基因型及遺傳符號說明（ 1） ? 甲基化相關的基因型 dam(DNA adenine methylase)表達 DNA腺嘌呤甲基化酶，它能催化特異序列 GATC中 A的甲基化，保證 DNA免受限制性核酸內切酶 MboI的切斷，同時在 DNA復制時也起一定的輔助作用。 DNase催化雙鏈 DNA的解旋和解鏈，核酸外切酶 V催化單鏈 DNA的 裂解，在 DNA的重組和損傷修復中發(fā)揮重要作用。 DelrecA說明此菌株的表現(xiàn)型是重組缺陷的?；蛐停?recA1， endA1， gyrA96，thi－ 1， hsdR17， supE44， relA1， Δ（ lac－ proAB） /F’[traD36， proAB+， lacIq，lacZΔM15] ? TOP10菌株 適用于高效的 DNA克隆和質粒擴增，能保證高拷貝質粒的穩(wěn)定遺傳。該菌適合表達非毒性蛋白?？捎糜谒{白斑篩選鑒別重組菌株。缺失 E3的重組腺病毒不需要輔助病毒。缺失 E1的重組腺病毒必須在已經被腺病毒（輔助病毒）感染的細胞中繁殖?；虮磉_時間短。 （四）重組腺病毒 DNA在細胞中的生存 （ 1）以游離的附加體形式存在于細胞中。 （ 3）把質粒切成線性 （ 4）共同轉染細胞。 （ 2）構建質粒載體。 （ 1）刪除腺病毒 DNA一些非必需區(qū)。 （三）腺病毒載體 目前最常用的基因治療載體之一。 （ 5）腺病毒容易制備、純化。 （ 3）可以在呼吸道和腸道中繁殖，可以通過口服或噴霧的方式感染。 （二）腺病毒的優(yōu)點： （ 1）比較安全，無致病、致癌、致畸作用。（反轉錄病毒一般只感染處在分裂狀態(tài)的細胞） DNA病毒載體 —腺病毒載體 （一）腺病毒的基因組：是線狀雙鏈 DNA病毒，基因組中有 14個基因。 （ 4）包裝的外源 DNA可達 10kb。 （ 2）侵染范圍廣、感染率高。轉入的載體 DNA上帶有 y+，轉錄成的載體 RNA就會被包裝細胞中原有的病毒外殼蛋白識別包裝成重組病毒顆粒。用兩個缺失了y+的反轉錄病毒染色體轉化細胞，以制造病毒外殼蛋白。 （ 2）插入標記基因（如 neor） （ 3）外源基因和啟動子插入到 y+下游。 ? gag：核心蛋白。 ? env：外殼蛋白。 ? U U3： 5’段或 3’端獨特序列。整合時，整合酶在 U5U3連接處切開雙鏈 DNA，隨機插入到宿主基因組里。 ? LTR是長末端重復序列。兩個相同的 RNA分子在 5’端附近經氫鍵連接形成 70S RNA，這種結構可能在逆轉錄過程中起調節(jié)作用。目前病毒載體常用者有改造來自猴腎病毒 SV40（ Simian Virus 40）、逆轉錄病毒和昆蟲桿狀病毒等，使用這些病毒載體的目的多為將目的基因或序列放入動物細胞中表達或作基因治療等。由于動物細胞的培養(yǎng)和操作較復雜、花費也較多，因而病毒載體構建時一般都把細菌質粒復制起始序列放置其中。 載體類型 存在方式 所需 DNA序列 標記基因 轉化頻率（菌 落 /μgDNA） 穩(wěn)定性 無絲分裂 有絲分裂 整合型 (YIp5) 整合 1幾個拷貝 與染色體 DNA同源 Apr Tcr URA3 10 +a +a 附加體型(YEp13) 自主復制多拷貝 2μ質粒 Apr Tcr LEU2 103104 b c 復制型 (YRp7) 自主復制多拷貝 ARS Apr Tcr TRP1 103104 b c 著絲粒型(YCp19) 染色體狀通常單拷貝 ARS,CEN Apr TRP1,URA3 103104 +d +d 線型 (YLp21) 染色體狀通常單 拷貝 ARS