【正文】 pUC origin是大腸桿菌復(fù)制區(qū)序列，可引導(dǎo)雙鏈 DNA復(fù)制過程。 六、質(zhì)粒載體的不穩(wěn)定性 2. 質(zhì)粒分配方式： 有主動(dòng)分配和隨機(jī)分配兩種假說。 IS dimer 重組 5. 影響質(zhì)粒載體穩(wěn)定性的主要因素 （ 1）新陳代謝負(fù)荷： a、復(fù)制負(fù)荷 b、轉(zhuǎn)錄和翻譯負(fù)荷 使寄主細(xì)胞生長減緩：質(zhì)粒載體使寄主的世代時(shí)間延長約 15%。 二聚體質(zhì)粒的復(fù)制速度是單體的二倍！導(dǎo)致質(zhì)粒失控。全長 48531bp，含 50多個(gè)基因。 λcl ts1857可作為組件插入質(zhì)粒 DNA內(nèi) 。 載體類型： 插入型載體： 通過特定的酶切位點(diǎn)允許外源 DNA片斷插入的載體（ 011kb) 。 M13 噬菌體的基因組為單鏈 DNA （ +DNA），由 6407 的堿基組成。雄性菌的遺傳物質(zhì)能通過性菌毛傳遞給 F菌，這個(gè)過程稱為接合。 2） M13 噬菌體載體組成 現(xiàn)在所使用的 M13 噬菌體載體是 Messing 及其同事建立的 mp 系列載體，以基因 Ⅱ 和基因 Ⅳ 之間的區(qū)域作為外源 DNA 插入?yún)^(qū)。在 M13mp2的 LacZ’的 5‘端加上一段人工合成的多克隆位點(diǎn)（ MCS）。故用 M13mpl8 和 M13mpl9 作為一對載體，就可能用一個(gè)引物 ，從所插入 DNA 片段的任一端開始，測定互為相反的兩條鏈的 DNA 序列，并可制備只與外源 DNA 的任意一條鏈互補(bǔ)的 DNA 探針。本意是帶有粘性末端位點(diǎn)的質(zhì)粒 , 因此 , 柯斯質(zhì)粒是人工建造的的含有 λDNA的 cos序列和質(zhì)粒復(fù)制子的特殊類型的質(zhì)粒載體。但許多噬菌粒都有一個(gè)主要缺點(diǎn)，即輔助噬菌體感染后，有時(shí)候單鏈 DNA 的產(chǎn)量較低且重復(fù)性較差。 （ 4）克隆位點(diǎn) 克隆位點(diǎn)位于 SUP4 基因內(nèi)部。 （二） YAC的特點(diǎn) （ 1）只能在酵母細(xì)胞中擴(kuò)增。（真核生物中只有酵母菌有 ARS） （ 4）克隆位點(diǎn)：位于 SUP4 基因內(nèi)部。酵母端粒保守序列是 (G4T2)n 重復(fù)序列。 （ 6）在細(xì)菌中操作：細(xì)菌的復(fù)制起點(diǎn) ori和抗生素標(biāo)記 Amp r 。 （五） YAC轉(zhuǎn)化過程 （ 1）宿主酵母菌： trp 和 ura。 一、反轉(zhuǎn)錄病毒載體 ? 屬于正鏈 RNA病毒，顯著的特點(diǎn)是具有 2倍體基因組。 ? y+：組裝時(shí)必需的非編碼序列。 （ 2）載體 RNA的包裝 用載體 DNA轉(zhuǎn)化包裝細(xì)胞系。共同特點(diǎn)是都帶有倒置的末端重復(fù)（ ITR），在病毒的復(fù)制過程中起非常重要的作用。 腺病毒載體的構(gòu)建 :用同源重組的方法插入外源基因。不能整合到細(xì)胞基因組中。基因型： F， φ80dlacZΔM15，Δ(lacZYAargF)U169， deoR， recA1， endA1， hsdR17(rk， mk+)， phoA， supE44，λ， thi1， gyrA96， relA1 ? BL21(DE3)菌株 用于高效表達(dá)克隆于含有噬菌體 T7啟動(dòng)子的表達(dá)載體（如 pET系列）的基因。 recC(Rebination)表達(dá)核酸外切酶 V、 ATP依賴型的核酸內(nèi)切酶、解旋酶和 ATP酶，它們和 recA, recB所表達(dá)的酶相互協(xié)調(diào)作用，在 DNA的重組及放射性損傷的修復(fù)中發(fā)揮作用。 (2)hsdM (Host specificitive defective Methylation) ? DNA甲基化酶 ? 識(shí)別特定位點(diǎn)并甲基化 (3)hsdS ? 輔助 hsdR和 hsdMD ? 停止密碼子相關(guān)的基因型 supE(Suppressor E)表達(dá)的阻遏蛋白與停止密碼子 UAG結(jié)合，使蛋白質(zhì)合成停止。 DNA促旋酶在 DNA復(fù)制時(shí)具有使 DNA解旋和回旋的作用。 lacZ 基因的變異或缺失將直接導(dǎo)致 β半乳糖苷酶活性缺失。 proA基因的變異或缺失，使脯氨酸的生物合成受阻，在用最小培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)需要特別添加脯氨酸。 thi(Thiamin)表達(dá)硫胺素，包含有 thiA 、 thiB 、 thiC 、 thiD 、 thiK 、 thiL 等。這種受體蛋白與鐵絡(luò)合物結(jié)合，并與 tonB 蛋白相互協(xié)調(diào)作用，把鐵化合物運(yùn)至細(xì)胞質(zhì)中。 deo操縱子含有 deoA、 deoB、 deoC和 deoD等結(jié)構(gòu)基因，分別表達(dá)DNA代謝所需的酶類，即胸腺嘧啶磷酸化酶、磷酸轉(zhuǎn)位酶、脫氧核糖磷酸醛縮酶和嘌呤核苷磷酸化酶。 ii. DH5α和 DH5αF’都具有一個(gè)可供遺傳標(biāo)記 lacZα檢測的遺傳背景。 組成型啟動(dòng)子 (constitutive promoter)是指在該類啟動(dòng)子控制下，結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)大體恒定在一定水平上，在不同組織、部位表達(dá)水平?jīng)]有明顯差異。 終止子 終止子可分為兩類：一類不依賴于蛋白質(zhì)輔因子就能實(shí)現(xiàn)終止作用。 :24:3312:24Feb2326Feb23 ? 1故人江海別，幾度隔山川。 , February 26, 2023 ? 很多事情努力了未必有結(jié)果，但是不努力卻什么改變也沒有。 2023年 2月 26日星期日 12時(shí) 24分 33秒 12:24:3326 February 2023 ? 1空山新雨后，天氣晚來秋。 :24:3312:24:33February 26, 2023 ? 1意志堅(jiān)強(qiáng)的人能把世界放在手中像泥塊一樣任意揉捏。 。在轉(zhuǎn)錄終止點(diǎn)前有一段回文序列。 CMV是大家公認(rèn)的啟動(dòng)真核基因表達(dá)的最有力量的啟動(dòng)子。 ? 啟動(dòng)子本身并不控制基因活動(dòng)，而是通過與稱為轉(zhuǎn)錄（ transcription）因子的這種蛋白質(zhì)（ proteins）結(jié)合而控制基因活動(dòng)的。 tyrT(Tyrosine)基因?qū)ｉT負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)錄酪氨酸 tRNA(轉(zhuǎn)運(yùn) RNA)， tyrT基因的變異使以酪氨酸為主的蛋白質(zhì)的合成受阻。 tsx 基因的變異使外界某些噬菌體及大腸桿菌素等對細(xì)胞的侵噬變得困難，有利于細(xì)胞基因組的穩(wěn)定。 lon基因的變異或缺失，使細(xì)胞中的這種異型蛋白質(zhì)分解酶不能得到表達(dá)，這對于保持克隆體目的蛋白的穩(wěn)定是非常有利的。 thrA表達(dá)天冬氨酸激酶及 I高絲氨酸脫氫酶，thrB表達(dá)高絲氨酸激酶， thrC表述蘇氨酸合成酶。 gal(Galactose)表達(dá)半乳糖代謝所需的各種酶類及調(diào)節(jié)蛋白，其中 galE表達(dá)尿苷二磷酸 (UDG)半乳糖 4差向異構(gòu)酶、 galK表達(dá)半乳糖激酶、 galP表達(dá)半乳糖透性酶、 galR表達(dá)半乳糖操縱子的阻遏蛋白、 galT表達(dá)半乳糖 1磷酸尿苷酰轉(zhuǎn)移酶、 galU表達(dá)葡萄糖 1磷酸尿苷酰轉(zhuǎn)移酶。 Tn5(Transposon)是帶有卡那霉素 (Kanamycine)抗性基因的轉(zhuǎn)座子，當(dāng) Tn5轉(zhuǎn)位到大腸桿菌基因組時(shí)，能使此菌株獲得卡那霉素的抗性 (Kan r)。 大腸桿菌基因型及遺傳符號(hào)說明（ 4） ? 點(diǎn)突變相關(guān)的基因型 mutS(Mutator)表達(dá)的蛋白具有識(shí)別 DNA上錯(cuò)配序列的功能，并能修復(fù)其錯(cuò)配序列（ GC→AT），防止基因突變。 大腸桿菌基因型及遺傳符號(hào)說明（ 2） ? 核酸內(nèi)切酶相關(guān)的基因型 hsdR表達(dá) I型限制酶 EcoK(K12株 )或 EcoB(B株 )，在大腸桿菌細(xì)胞中起到一種”抗體“的作用，對外來的各種 DNA有嚴(yán)格的限制?；蛐停?F ， mcrAΔ(mrrhsd RMSmcrBC)， φ80 ， lacZΔM15，△ lacⅩ74， recA1 ，araΔ139Δ(araleu)7697， galU ， galK ， rps， (Strr) endA1， nupG 基因工程中常用的工程菌 ? 基因重組相關(guān)的基因型 recA(Rebination)表達(dá) ATP依賴型 DNA重組酶，具有對 DNA放射性損傷的修復(fù)功能。 （ 3） E3區(qū)對腺病毒的繁殖不是必需的。含有 E1或 E3區(qū)兩側(cè)的同源序列，并在同源序列之間插入外源基因和選擇標(biāo)記基因。 （ 4）載體中的插入片斷可達(dá) （有包裝容量限制）。 （ 3）整合的原病毒在宿主基因中比較穩(wěn)定， 拷貝數(shù)目較低。 （三）反轉(zhuǎn)錄病毒載體構(gòu)建 （ 1）刪除 pol、 env和 gag基因。在病毒基因組整合中至關(guān)重要。感染動(dòng)物的病毒可改造用作動(dòng)物細(xì)胞的載體。 對于線形化的微型酵母染色體，當(dāng)切割抑制基因 sup4 內(nèi)部的位點(diǎn)后形成染色體的兩條臂，與外源大片段 DNA 在該切點(diǎn)相連就形成一個(gè)大型人工酵母染色體，通過轉(zhuǎn)化進(jìn)入到酵母菌后可象染色體一樣復(fù)制，并隨細(xì)胞分裂分配到子細(xì)胞中，達(dá)到克隆大片段 DNA 的目的。 （ 5）選擇標(biāo)記： YAC 載體的選擇標(biāo)記主要采用營養(yǎng)缺陷型基因，如色氨酸、亮氨酸和組氨酸合成缺陷型基因 trp leu 2和 his 尿嘧啶合成缺陷型基因 ura3 等，以及赭石突變抑制基因 sup4 。利用這一菌落顏色轉(zhuǎn)變的現(xiàn)象，可用于篩選載體中含有外源 DNA 片段插入的重組子。 （ 2）端粒（ TEL）：兩個(gè)端粒序列 Tel。 （ 2）著絲粒（ centromere， CEN）：有絲分裂過程中紡錘絲的結(jié)合位點(diǎn)，使染色體在分裂過程中能正確分配到子細(xì)胞中。 （ 1） DNA復(fù)制起始點(diǎn)（ ori） （ 2）著絲粒（ centromere， cen） （ 3）兩個(gè)端粒（ telomeres， tel） 染色體復(fù)制和遺傳的三個(gè)基本組件： TEL TEL CEN ORI （ 1）著絲粒區(qū)（ CEN） A A GTCACGTG T TGTTTCTGNTTTCCGAAA 酵母染色體著絲粒區(qū)的保守序列 : I II III 7886bp 酵母第 11號(hào)染色體的著絲粒區(qū)序列 YAC的組成結(jié)構(gòu) （ 2）端粒（ TEL） 兩個(gè)端粒 保守序列 是 (G4T2)n 重復(fù)序列。含噬菌粒的細(xì)菌被噬菌體感染后，基因 Ⅱ 蛋白可作用于噬菌粒的間隔區(qū)，啟動(dòng)滾環(huán)復(fù)制產(chǎn)生 ssDNA 并進(jìn)行包裝。 （ 4）可以克隆雙鏈 DNA分子中的每一條鏈（子代 M13噬菌體中包含的是單連+DNA）。 M13mpl8 和 M13mpl9 輕易不能重新環(huán)化。 3） M13載體系列 ① M13載體系列的命名： M13mpn， n代表系列數(shù)字。 RF DNA 很容易從感染細(xì)胞中純化出來，可以象質(zhì)粒一樣進(jìn)行操作，并可通過轉(zhuǎn)化方法再次導(dǎo)入細(xì)胞。 M13沒有包裝限制： 單鏈?zhǔn)删w的特點(diǎn)： （ 1）存在兩種類型， ssDNA和 RF dsDNA； （ 2） +DNA（ ssDNA）； （ 3）復(fù)制型（ RF）是雙鏈環(huán)狀 DNA； （ 4） RF dsDNA和 ssDNA都能轉(zhuǎn)染感受態(tài)大腸桿菌，并產(chǎn)生噬菌斑； （ 5）不存在包裝限制； （ 6）可產(chǎn)生大量的含有外源 DNA插入片斷的單鏈分子，便于作探針或測序。 代表性 λ噬菌體載體 插入型載體 λgt10 載體 置換型載體 EMBL3 基因 cⅠ 被 一段來自 ?434 噬菌體的片段 imm434替換了 ，其中內(nèi)有一個(gè) EcoRⅠ 位點(diǎn)。把 λ 啟動(dòng)子連同其附屬成分，將 pBR322的 tetr基因進(jìn)行替換，成為以 λ 啟動(dòng)子為組件的質(zhì)粒。 λCI ts857 λ 噬菌體從溶原轉(zhuǎn)為裂解是一種可誘導(dǎo)過程 。 二、噬菌體的生活周期 1. 溶菌周期 烈性噬菌體 感染細(xì)菌后，立即在菌體內(nèi)復(fù)制 DNA和合成外殼蛋白質(zhì)，重新組裝成噬菌體顆粒，并導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞解體，釋放出大量子代噬菌體。 低拷貝數(shù)的質(zhì)粒的差度小，遺傳穩(wěn)定。人工構(gòu)建的質(zhì)粒載體缺失了 par區(qū)，只能以隨機(jī)分配方式分到子細(xì)胞中。 1) 特點(diǎn) : a. 基因的啟動(dòng)子序列和終止子序列； b. 一般無檢測標(biāo)記基因； c. 克隆位點(diǎn)是確定的（即位于啟動(dòng)子序列后）； d. 重組分子用凝膠電泳檢出（依賴于分子量差異）。 pUC18載體 EcoR V的酶切位點(diǎn)： 常用的質(zhì)粒載體 穿梭質(zhì)粒載體 人工構(gòu)建的、具有兩種不同復(fù)制起點(diǎn)和選擇標(biāo)記、可以在兩種不同的寄主細(xì)胞中存活和復(fù)制的質(zhì)粒載體。 選擇方便。 pUC載體上 LacZ’的 5‘端有一段多克隆位點(diǎn) (MCS)區(qū)，本身雖不干擾 LacZ’的合成，但插入外源基因就會(huì)阻止LacZ’的合成。如 pUC pUC pUC pUC pUC1 pUC1 pUC19。不能通過接合轉(zhuǎn)移。 常用的質(zhì)粒載體 pBR322 元件來源 復(fù)制起點(diǎn) ori pMB1系列（來源于 ColE1）的高拷貝型復(fù)制起點(diǎn) Ampr基因 pSP2124質(zhì)粒的 Ampr基因 Tetr基因 pSC101的 Tetr 基因。只有帶有選擇標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)化菌細(xì)胞才能在選擇培養(yǎng)基上生長。 ?低拷貝數(shù)的質(zhì)粒載體 由 pSC101派生來的載體特點(diǎn)是分子量小，拷貝數(shù)低，不適合大量擴(kuò)增 DNA用。 鏈霉素抗性（ Strr） :鏈霉素通過與 30S核糖體亞基結(jié)合，導(dǎo)致 mRNA錯(cuò)譯，從而殺死細(xì)菌。 質(zhì)粒的選擇標(biāo)記及其工作原理： ?抗菌素抗性 絕大多數(shù)質(zhì)粒載體都是用抗菌素抗性標(biāo)記 . 氨芐青霉素抗性（ Ampr） :青霉素的衍生物。 ?質(zhì)粒載體的發(fā)展概況 第