【正文】 pUC origin是大腸桿菌復(fù)制區(qū)序列，可引導(dǎo)雙鏈 DNA復(fù)制過程。 六、質(zhì)粒載體的不穩(wěn)定性 2. 質(zhì)粒分配方式： 有主動分配和隨機分配兩種假說。 IS dimer 重組 5. 影響質(zhì)粒載體穩(wěn)定性的主要因素 （ 1）新陳代謝負荷： a、復(fù)制負荷 b、轉(zhuǎn)錄和翻譯負荷 使寄主細胞生長減緩：質(zhì)粒載體使寄主的世代時間延長約 15%。 二聚體質(zhì)粒的復(fù)制速度是單體的二倍！導(dǎo)致質(zhì)粒失控。全長 48531bp，含 50多個基因。 λcl ts1857可作為組件插入質(zhì)粒 DNA內(nèi) 。 載體類型： 插入型載體： 通過特定的酶切位點允許外源 DNA片斷插入的載體（ 011kb) 。 M13 噬菌體的基因組為單鏈 DNA （ +DNA），由 6407 的堿基組成。雄性菌的遺傳物質(zhì)能通過性菌毛傳遞給 F菌，這個過程稱為接合。 2） M13 噬菌體載體組成 現(xiàn)在所使用的 M13 噬菌體載體是 Messing 及其同事建立的 mp 系列載體，以基因 Ⅱ 和基因 Ⅳ 之間的區(qū)域作為外源 DNA 插入?yún)^(qū)。在 M13mp2的 LacZ’的 5‘端加上一段人工合成的多克隆位點（ MCS）。故用 M13mpl8 和 M13mpl9 作為一對載體，就可能用一個引物 ，從所插入 DNA 片段的任一端開始，測定互為相反的兩條鏈的 DNA 序列，并可制備只與外源 DNA 的任意一條鏈互補的 DNA 探針。本意是帶有粘性末端位點的質(zhì)粒 , 因此 , 柯斯質(zhì)粒是人工建造的的含有 λDNA的 cos序列和質(zhì)粒復(fù)制子的特殊類型的質(zhì)粒載體。但許多噬菌粒都有一個主要缺點，即輔助噬菌體感染后，有時候單鏈 DNA 的產(chǎn)量較低且重復(fù)性較差。 （ 4）克隆位點 克隆位點位于 SUP4 基因內(nèi)部。 （二） YAC的特點 （ 1）只能在酵母細胞中擴增。（真核生物中只有酵母菌有 ARS） （ 4）克隆位點：位于 SUP4 基因內(nèi)部。酵母端粒保守序列是 (G4T2)n 重復(fù)序列。 （ 6）在細菌中操作：細菌的復(fù)制起點 ori和抗生素標記 Amp r 。 （五） YAC轉(zhuǎn)化過程 （ 1）宿主酵母菌： trp 和 ura。 一、反轉(zhuǎn)錄病毒載體 ? 屬于正鏈 RNA病毒，顯著的特點是具有 2倍體基因組。 ? y+：組裝時必需的非編碼序列。 （ 2）載體 RNA的包裝 用載體 DNA轉(zhuǎn)化包裝細胞系。共同特點是都帶有倒置的末端重復(fù)（ ITR），在病毒的復(fù)制過程中起非常重要的作用。 腺病毒載體的構(gòu)建 :用同源重組的方法插入外源基因。不能整合到細胞基因組中?；蛐停?F， φ80dlacZΔM15，Δ(lacZYAargF)U169， deoR， recA1， endA1， hsdR17(rk， mk+)， phoA， supE44，λ， thi1， gyrA96， relA1 ? BL21(DE3)菌株 用于高效表達克隆于含有噬菌體 T7啟動子的表達載體（如 pET系列）的基因。 recC(Rebination)表達核酸外切酶 V、 ATP依賴型的核酸內(nèi)切酶、解旋酶和 ATP酶，它們和 recA, recB所表達的酶相互協(xié)調(diào)作用，在 DNA的重組及放射性損傷的修復(fù)中發(fā)揮作用。 (2)hsdM (Host specificitive defective Methylation) ? DNA甲基化酶 ? 識別特定位點并甲基化 (3)hsdS ? 輔助 hsdR和 hsdMD ? 停止密碼子相關(guān)的基因型 supE(Suppressor E)表達的阻遏蛋白與停止密碼子 UAG結(jié)合，使蛋白質(zhì)合成停止。 DNA促旋酶在 DNA復(fù)制時具有使 DNA解旋和回旋的作用。 lacZ 基因的變異或缺失將直接導(dǎo)致 β半乳糖苷酶活性缺失。 proA基因的變異或缺失，使脯氨酸的生物合成受阻，在用最小培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞時需要特別添加脯氨酸。 thi(Thiamin)表達硫胺素，包含有 thiA 、 thiB 、 thiC 、 thiD 、 thiK 、 thiL 等。這種受體蛋白與鐵絡(luò)合物結(jié)合，并與 tonB 蛋白相互協(xié)調(diào)作用，把鐵化合物運至細胞質(zhì)中。 deo操縱子含有 deoA、 deoB、 deoC和 deoD等結(jié)構(gòu)基因，分別表達DNA代謝所需的酶類，即胸腺嘧啶磷酸化酶、磷酸轉(zhuǎn)位酶、脫氧核糖磷酸醛縮酶和嘌呤核苷磷酸化酶。 ii. DH5α和 DH5αF’都具有一個可供遺傳標記 lacZα檢測的遺傳背景。 組成型啟動子 (constitutive promoter)是指在該類啟動子控制下，結(jié)構(gòu)基因的表達大體恒定在一定水平上，在不同組織、部位表達水平?jīng)]有明顯差異。 終止子 終止子可分為兩類：一類不依賴于蛋白質(zhì)輔因子就能實現(xiàn)終止作用。 :24:3312:24Feb2326Feb23 ? 1故人江海別，幾度隔山川。 , February 26, 2023 ? 很多事情努力了未必有結(jié)果，但是不努力卻什么改變也沒有。 2023年 2月 26日星期日 12時 24分 33秒 12:24:3326 February 2023 ? 1空山新雨后，天氣晚來秋。 :24:3312:24:33February 26, 2023 ? 1意志堅強的人能把世界放在手中像泥塊一樣任意揉捏。 。在轉(zhuǎn)錄終止點前有一段回文序列。 CMV是大家公認的啟動真核基因表達的最有力量的啟動子。 ? 啟動子本身并不控制基因活動，而是通過與稱為轉(zhuǎn)錄（ transcription）因子的這種蛋白質(zhì)（ proteins）結(jié)合而控制基因活動的。 tyrT(Tyrosine)基因?qū)ｉT負責(zé)轉(zhuǎn)錄酪氨酸 tRNA(轉(zhuǎn)運 RNA)， tyrT基因的變異使以酪氨酸為主的蛋白質(zhì)的合成受阻。 tsx 基因的變異使外界某些噬菌體及大腸桿菌素等對細胞的侵噬變得困難，有利于細胞基因組的穩(wěn)定。 lon基因的變異或缺失，使細胞中的這種異型蛋白質(zhì)分解酶不能得到表達，這對于保持克隆體目的蛋白的穩(wěn)定是非常有利的。 thrA表達天冬氨酸激酶及 I高絲氨酸脫氫酶，thrB表達高絲氨酸激酶， thrC表述蘇氨酸合成酶。 gal(Galactose)表達半乳糖代謝所需的各種酶類及調(diào)節(jié)蛋白，其中 galE表達尿苷二磷酸 (UDG)半乳糖 4差向異構(gòu)酶、 galK表達半乳糖激酶、 galP表達半乳糖透性酶、 galR表達半乳糖操縱子的阻遏蛋白、 galT表達半乳糖 1磷酸尿苷酰轉(zhuǎn)移酶、 galU表達葡萄糖 1磷酸尿苷酰轉(zhuǎn)移酶。 Tn5(Transposon)是帶有卡那霉素 (Kanamycine)抗性基因的轉(zhuǎn)座子，當(dāng) Tn5轉(zhuǎn)位到大腸桿菌基因組時，能使此菌株獲得卡那霉素的抗性 (Kan r)。 大腸桿菌基因型及遺傳符號說明（ 4） ? 點突變相關(guān)的基因型 mutS(Mutator)表達的蛋白具有識別 DNA上錯配序列的功能，并能修復(fù)其錯配序列（ GC→AT），防止基因突變。 大腸桿菌基因型及遺傳符號說明（ 2） ? 核酸內(nèi)切酶相關(guān)的基因型 hsdR表達 I型限制酶 EcoK(K12株 )或 EcoB(B株 )，在大腸桿菌細胞中起到一種”抗體“的作用，對外來的各種 DNA有嚴格的限制?；蛐停?F ， mcrAΔ(mrrhsd RMSmcrBC)， φ80 ， lacZΔM15，△ lacⅩ74， recA1 ，araΔ139Δ(araleu)7697， galU ， galK ， rps， (Strr) endA1， nupG 基因工程中常用的工程菌 ? 基因重組相關(guān)的基因型 recA(Rebination)表達 ATP依賴型 DNA重組酶，具有對 DNA放射性損傷的修復(fù)功能。 （ 3） E3區(qū)對腺病毒的繁殖不是必需的。含有 E1或 E3區(qū)兩側(cè)的同源序列，并在同源序列之間插入外源基因和選擇標記基因。 （ 4）載體中的插入片斷可達 （有包裝容量限制）。 （ 3）整合的原病毒在宿主基因中比較穩(wěn)定， 拷貝數(shù)目較低。 （三）反轉(zhuǎn)錄病毒載體構(gòu)建 （ 1）刪除 pol、 env和 gag基因。在病毒基因組整合中至關(guān)重要。感染動物的病毒可改造用作動物細胞的載體。 對于線形化的微型酵母染色體，當(dāng)切割抑制基因 sup4 內(nèi)部的位點后形成染色體的兩條臂，與外源大片段 DNA 在該切點相連就形成一個大型人工酵母染色體，通過轉(zhuǎn)化進入到酵母菌后可象染色體一樣復(fù)制，并隨細胞分裂分配到子細胞中，達到克隆大片段 DNA 的目的。 （ 5）選擇標記： YAC 載體的選擇標記主要采用營養(yǎng)缺陷型基因，如色氨酸、亮氨酸和組氨酸合成缺陷型基因 trp leu 2和 his 尿嘧啶合成缺陷型基因 ura3 等，以及赭石突變抑制基因 sup4 。利用這一菌落顏色轉(zhuǎn)變的現(xiàn)象，可用于篩選載體中含有外源 DNA 片段插入的重組子。 （ 2）端粒（ TEL）：兩個端粒序列 Tel。 （ 2）著絲粒（ centromere， CEN）：有絲分裂過程中紡錘絲的結(jié)合位點，使染色體在分裂過程中能正確分配到子細胞中。 （ 1） DNA復(fù)制起始點（ ori） （ 2）著絲粒（ centromere， cen） （ 3）兩個端粒（ telomeres， tel） 染色體復(fù)制和遺傳的三個基本組件： TEL TEL CEN ORI （ 1）著絲粒區(qū)（ CEN） A A GTCACGTG T TGTTTCTGNTTTCCGAAA 酵母染色體著絲粒區(qū)的保守序列 : I II III 7886bp 酵母第 11號染色體的著絲粒區(qū)序列 YAC的組成結(jié)構(gòu) （ 2）端粒（ TEL） 兩個端粒 保守序列 是 (G4T2)n 重復(fù)序列。含噬菌粒的細菌被噬菌體感染后，基因 Ⅱ 蛋白可作用于噬菌粒的間隔區(qū)，啟動滾環(huán)復(fù)制產(chǎn)生 ssDNA 并進行包裝。 （ 4）可以克隆雙鏈 DNA分子中的每一條鏈（子代 M13噬菌體中包含的是單連+DNA）。 M13mpl8 和 M13mpl9 輕易不能重新環(huán)化。 3） M13載體系列 ① M13載體系列的命名： M13mpn， n代表系列數(shù)字。 RF DNA 很容易從感染細胞中純化出來，可以象質(zhì)粒一樣進行操作，并可通過轉(zhuǎn)化方法再次導(dǎo)入細胞。 M13沒有包裝限制： 單鏈噬菌體的特點： （ 1）存在兩種類型， ssDNA和 RF dsDNA； （ 2） +DNA（ ssDNA）； （ 3）復(fù)制型（ RF）是雙鏈環(huán)狀 DNA； （ 4） RF dsDNA和 ssDNA都能轉(zhuǎn)染感受態(tài)大腸桿菌，并產(chǎn)生噬菌斑； （ 5）不存在包裝限制； （ 6）可產(chǎn)生大量的含有外源 DNA插入片斷的單鏈分子，便于作探針或測序。 代表性 λ噬菌體載體 插入型載體 λgt10 載體 置換型載體 EMBL3 基因 cⅠ 被 一段來自 ?434 噬菌體的片段 imm434替換了 ，其中內(nèi)有一個 EcoRⅠ 位點。把 λ 啟動子連同其附屬成分，將 pBR322的 tetr基因進行替換，成為以 λ 啟動子為組件的質(zhì)粒。 λCI ts857 λ 噬菌體從溶原轉(zhuǎn)為裂解是一種可誘導(dǎo)過程 。 二、噬菌體的生活周期 1. 溶菌周期 烈性噬菌體 感染細菌后，立即在菌體內(nèi)復(fù)制 DNA和合成外殼蛋白質(zhì)，重新組裝成噬菌體顆粒，并導(dǎo)致細菌細胞解體，釋放出大量子代噬菌體。 低拷貝數(shù)的質(zhì)粒的差度小，遺傳穩(wěn)定。人工構(gòu)建的質(zhì)粒載體缺失了 par區(qū)，只能以隨機分配方式分到子細胞中。 1) 特點 : a. 基因的啟動子序列和終止子序列； b. 一般無檢測標記基因； c. 克隆位點是確定的（即位于啟動子序列后）； d. 重組分子用凝膠電泳檢出（依賴于分子量差異）。 pUC18載體 EcoR V的酶切位點： 常用的質(zhì)粒載體 穿梭質(zhì)粒載體 人工構(gòu)建的、具有兩種不同復(fù)制起點和選擇標記、可以在兩種不同的寄主細胞中存活和復(fù)制的質(zhì)粒載體。 選擇方便。 pUC載體上 LacZ’的 5‘端有一段多克隆位點 (MCS)區(qū)，本身雖不干擾 LacZ’的合成，但插入外源基因就會阻止LacZ’的合成。如 pUC pUC pUC pUC pUC1 pUC1 pUC19。不能通過接合轉(zhuǎn)移。 常用的質(zhì)粒載體 pBR322 元件來源 復(fù)制起點 ori pMB1系列（來源于 ColE1）的高拷貝型復(fù)制起點 Ampr基因 pSP2124質(zhì)粒的 Ampr基因 Tetr基因 pSC101的 Tetr 基因。只有帶有選擇標記基因的轉(zhuǎn)化菌細胞才能在選擇培養(yǎng)基上生長。 ?低拷貝數(shù)的質(zhì)粒載體 由 pSC101派生來的載體特點是分子量小，拷貝數(shù)低，不適合大量擴增 DNA用。 鏈霉素抗性（ Strr） :鏈霉素通過與 30S核糖體亞基結(jié)合，導(dǎo)致 mRNA錯譯，從而殺死細菌。 質(zhì)粒的選擇標記及其工作原理： ?抗菌素抗性 絕大多數(shù)質(zhì)粒載體都是用抗菌素抗性標記 . 氨芐青霉素抗性（ Ampr） :青霉素的衍生物。 ?質(zhì)粒載體的發(fā)展概況 第