高等植物基因工程(2)(編輯修改稿)
2024-10-03 11:34 本頁面
【文章內容簡介】 利于克隆操作 。 3） 除去 Ti質粒上的其它非必需序列 ， 最大限度地縮短載體長度 。 5） 安裝植物細胞篩選標記 （ 如新霉素抗性基因neor） 、 植物基因啟動子 、 polyA化信號序列 。 6） 安裝 MCS， 以利于外源基因的克隆 。 共整合轉化程序 質粒上的 重組 TDNA和根癌農桿菌中的 野生型 TDNA之間的同源重組率不高， 導致 轉化效率較低 。 大腸桿菌質粒大腸桿菌篩選標記農桿菌篩選標記多克隆位點重組質粒轉化大腸桿菌農桿菌細菌接合 T D N A 區(qū)同源整合農桿菌感染植物根部細胞 T D N A 區(qū)整合在植物細胞基因組上重組 LB RBT DN A外源基因植物細胞篩選標記 Km r大腸桿菌 農桿菌穿梭質粒大腸桿菌篩選標記農桿菌篩選標記農桿菌 ori大腸桿菌 ori將外源基因克隆在 大腸桿菌 農桿菌 穿梭質粒 的 TDNA區(qū)； 轉化攜帶 Ti輔助質粒 (只含 vir區(qū)、不含 TDNA區(qū) )的農桿菌； 重組農桿菌 感染植物細胞。 二元整合轉化程序 重組農桿菌轉化植物的方法： 葉盤法： 共培養(yǎng)法： 用重組農桿菌感染葉片外植體并短期共培養(yǎng) ， 不需進行原生質體操作。 把重組農桿菌 、 植物原生質體共培養(yǎng) 。 芽在生根培養(yǎng)基上 生根 感染葉盤在 選擇培養(yǎng)基上長出 愈傷組織和芽 葉片消毒、切割葉盤 與重組農桿菌共培養(yǎng) 葉盤法的程序 脫菌 移植再生植株 外源基因在整合入植物基因組中后 ， 不發(fā)生修飾改變 （ 如基因重排 ） 。 構建的轉基因植株再生效率高； 農桿菌介導的 Ti質粒轉化法的優(yōu)點： 成本低，轉化率高； 轉入的外源基因拷貝數(shù)低 ， 大多數(shù)為單拷貝 。 農桿菌介導的 Ti質粒轉化法的缺點： 宿主局限性 ， 主要用于雙子葉植物的遺傳轉化 。 農桿菌極少能感染單子葉植物 ， 一些重要的農作物 （ 如水稻 、 小麥 、 玉米等 ） 對其不敏感 。 根癌農桿菌介導的 Ti質粒轉化法是目前轉基因植物 最常用 的方法 ， 80%的轉基因植物是采用該方法獲得的 。 植物病毒廣泛存在 ， 且不受單子葉或雙子葉的限制 ， 因此以病毒作為植物基因工程載體日益受到重視 。 在 300種特征清楚的植物病毒中 ， 單鏈 RNA病毒占 91%， 雙鏈 RNA病毒 、 雙鏈 DNA病毒 、 單鏈DNA病毒各占 3%。 植物病毒介導的轉染 RNA操作困難 ， 不適合作為克隆載體 。 花椰菜花葉病毒 (CaMV)：雙鏈 DNA病毒 雙生病毒 (Geminivirus)：單鏈 DNA病毒 兩種常用的植物病毒載體： 轉染植物細胞原生質體 利用植物病毒載體轉化植物細胞的 戰(zhàn)略 ： 轉染植物組織 以雙鏈 DNA病毒 花椰菜花葉病毒 (CaMV)基因組為載體 ， 去除有關的致病基因 ， 換上外源基因 ， 體外包裝成有感染力的病毒顆粒 ， 轉染植物細胞原生質體 ， 由此再生成整株植物 。 1）轉染植物細胞原生質體 1） 即使切除基因組中的非必需序列 ， 其承載外源基因的能力還是有限 ， 只能插入很小的片段 。 花椰菜花葉病毒載體： 2） 宿主范圍非常窄 ， 主要是蕓苔屬植物 ， 如蕪菁 、 甘藍 、 花椰菜等 。 2）轉染植物組織 A鏈 能單獨在植物
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