基因工程課件2-2章(編輯修改稿)
2024-10-08 20:49 本頁(yè)面
【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 DNA進(jìn)入頭部蛋白， DNA充滿后， gpw和gpFⅡ 將頭部封住，然后與尾部相連，形成噬菌體顆粒。 vi. 裂解：基因 R和 S產(chǎn)物形成，細(xì)菌細(xì)胞裂解，噬菌體顆粒釋放。 vii. 溶源反應(yīng)： CⅡ 和 CⅢ 基因產(chǎn)物分別激活 PE和 PI的左向轉(zhuǎn)錄，致使 CI和 int基因表達(dá)， CI 產(chǎn)物可阻止早期轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致后期基因表達(dá)受阻。 對(duì)于裂解反應(yīng)和溶源反應(yīng)的選擇 ， 取決于感染細(xì)胞中一系列宿主和噬菌體因子間錯(cuò)綜復(fù)雜的精細(xì)平衡關(guān)系 。 * 當(dāng) λDNA注入宿主細(xì)胞后 ， 線狀 DNA首先環(huán)化為環(huán)狀DNA， 這種環(huán)化有以下幾點(diǎn)好處： a. 若為單向復(fù)制 ， 不管從何處開始復(fù)制 ， 全基因組均 可全部復(fù)制 b. 噬菌體 DNA插入宿主染色體 DNA， 只需一次位點(diǎn)特異性重組 c. 拓?fù)洚悩?gòu)酶易于對(duì)其進(jìn)行不足和過(guò)度加旋 d. 受損的基因組增大了存活的可能性 ， 因?yàn)殡p向復(fù)制不會(huì)受阻于 損傷的 DNA鏈 ， 而單向復(fù)制就不能通過(guò) 3) λDNA的復(fù)制 細(xì)胞外細(xì)胞內(nèi)4) λDNA的包裝過(guò)程 l 頭 — 尾連接器由 12分子 gpB構(gòu)成中空結(jié)構(gòu)， groE1和 groES負(fù)責(zé)裝配 l pX由 10個(gè)雜合的 gpC和 gpE構(gòu)成，使連接器定位 l gpW和 gpFⅡ 結(jié)合在連接器上，防止 DNA外泄，提供尾部粘著點(diǎn) 末端酶 由兩基因產(chǎn)物組成（ Nul和 A）， gpNul2gpA1 (20,444 x 2 + 72,280 = 113,168) 該酶具有以下多種酶活性 ： 1）特異 DNA位點(diǎn)結(jié)合； 2）特異位點(diǎn)切口形成； 3）頭前體結(jié)合； 4） gpFI結(jié)合； 5） cos位點(diǎn)變性； 6） DNA轉(zhuǎn)位； 7） DNA序列掃描； 8） ATP結(jié)合； 9）ATP水解。 因此，頭部蛋白 gpE和 gpD以及包裝蛋白 gpA是 λ DNA形成噬菌體顆粒必不可少的組分，體外包裝物的制備就是依據(jù)這一結(jié)論 頭 尾連接器g p B g p N u 3g p g r o E Lg p g r o E Sg p c. E g p N u 3g p E p x g p c g p A g p N u 1 E . co l iE . co l i IN F O r T H Fg p FII g p w g p D末端酶復(fù)合物I I ( F 1 可促進(jìn)該復(fù)合物形成）擴(kuò)張復(fù)合物Iλ DNAN u 1 左端 A B C N u 3 DE FI FIIWλ DNA的包裝 5） λDNA作載體的缺點(diǎn)和解決辦法 DNA的 78105%，即 Kb，天然 λ僅可插入 3 Kb外源 DNA片段 — 除去所有與 λ裂解無(wú)關(guān)的基因和空白區(qū)，最大可插入 22 Kb。 ，不利于外源 DNA插入 — 體內(nèi)突變和建立新的克隆位點(diǎn)。 ⅲ .重組的 λDNA分子難于直接導(dǎo)入宿主細(xì)胞 — 利用體外包裝成病毒顆粒，然后通過(guò)感染的方法注入 DNA。 6) λ載體的種類 i. 插入型 — 即將外源 DNA直接插入已構(gòu)建載體中，如λgt11，可以插入長(zhǎng)達(dá) 7 Kb的 DNA。這類載體被限制酶切成左右臂。 ⅱ .取代型 — 即利用一段外源 DNA去取代載體中的一段DNA，而這段 DNA常含有一定的標(biāo)記基因。這類載體常被限制酶切為三段：左臂、隔離段和右臂。 * 有的取代型 λ載體亦可用作插入型載體 ,如 Charon 4A 左臂 隔離段 右臂E X b E E 5 0 k b l a c 5 b i o 2 5 6 KH 5 4 n i n 5 QS R 8 0限制酶 克隆方式： E c o R I 取代法E E 2 0 . 1 k b 7 . 1 k bX b I 插入法 X b X b 5 . 6 4 0大腸桿菌 λ載體 Charon 4A r e d g a m r e d g a m P 2 導(dǎo)入 外源D N A 取代無(wú)噬菌斑λ+ λ P2導(dǎo)入滾環(huán)復(fù)制λSpi 重組子的篩選 7) λ載體的遺傳標(biāo)記基因和重組子篩選 由于 λ載體或重組 DNA是通過(guò)感染途徑進(jìn)入宿主細(xì)胞的，因而形成的噬菌斑就是一個(gè)明顯的標(biāo)記。用于重組子檢測(cè)的遺傳標(biāo)記基因主要有 lacZ 基因。不管是用插入或取代法，該標(biāo)記基因均會(huì)失活。 利用 spi選擇重組子 ：野生型 λ不能在 P2溶源化菌種中成活，稱之為 spi+(sensitive to P2 interference)，這與 red和 gam基因有關(guān)。若用外源 DNA將這些基因取代，形成的重組 DNA分子可在 P2菌中株中存活，并形成噬菌斑。 λ載體 λ105 均屬此類，這種選擇方式亦稱之為顯性選擇。 2. P1噬菌體載體 1) 基本結(jié)構(gòu)與特征 i. 基因組長(zhǎng) 88 kb, 在噬菌體顆粒中的 DNA長(zhǎng) 100 kb, 呈線狀 ,其中約有 12%的多余 DNA。
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