目的基因的獲取(編輯修改稿)
2025-09-11 23:06 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 文庫影印到其他濾膜上，以供篩選和低溫（ 80℃ ）保存。 ③制備已包裝的轉(zhuǎn)導(dǎo)性裂解物 適用于粘粒文庫，轉(zhuǎn)導(dǎo)性裂解物可以在低溫下長期保存。 （ 2） 基因組文庫的保存 小包裝，方便，避免反復(fù)凍融 噬菌體一類的基因文庫： 密封，加入少許 氯仿，在 4 ℃ 冰箱內(nèi)可較長時間地保存 （ 6個月），低溫冰箱可保存數(shù)年。 500kb 50300kb 100300kb，濃縮產(chǎn)物濃度達到 100ng/ul 三、 cDNA文庫的構(gòu)建 cDNA文庫：是指某種生物體某一發(fā)育時期所轉(zhuǎn)錄的 全部的 mRNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄形成的 cDNA片段 與某種載體連接而形成的克隆的集合。 cDNA文庫具有組織細(xì)胞特異性 ，具有時效性。 為什么要構(gòu)建 cDNA文庫？ 真核生物的基因組 DNA龐大且含有大量的重復(fù)序列，難以分離到目的基因片段。 1. cDNA 以 mRNA為模板逆轉(zhuǎn)錄出的 DNA稱 cDNA。 mRNA cDNA 3’ 3’ 5’ 5’ 反轉(zhuǎn)錄酶 引物 2. cDNA文庫的特點 （ 1）不含內(nèi)含子序列 （ 2）可以在細(xì)菌中直接表達 （ 3）包含了所有編碼蛋白質(zhì)的基因（時效性） （ 4）比基因組 DNA文庫小得多，容易構(gòu)建 3. 構(gòu)建 cDNA文庫的一般步驟 （ 1） mRNA的來源 特點 ： 多數(shù)基因的表達具有不同程度的組織特異 性和發(fā)育階段性。 選用 mRNA含量高的組織材料，或通過藥物等 方法提高 mRNA的含量。 高豐度 ： 當(dāng)特定的 mRNA在細(xì)胞總 mRNA群體中所占 比例達到 50～ 90％時。 低豐度 ： 當(dāng)上述比例小于 ％時。 分離 mRNA用商業(yè)化的 Oligo dT纖維柱。 利用真核生物 mRNA都含有一段 30～ 300個 A組成的polyA尾巴，將 mRNA從總 RNA（ rRNA、 tRNA等）中分離純化。 mRNA只占總 RNA的 1%5%。 （ 2） mRNA的分離純化 ① 原理 ② mRNA的分離純化 纖維素柱層析法 ③ mRNA的長度 哺乳動物 mRNA長度為 5008000bp，大部分 mRNA位于 。 反轉(zhuǎn)錄酶 （ 3） cDNA的合成 ① cDNA第一鏈合成 逆轉(zhuǎn)錄酶能以 RNA為模板合成 DNA。 a. Oligo dT引導(dǎo)合成法 從 3’開始，無法到達 5’末端 mRNA cDNA 3’ 5’ 5’ AAAAAAA TTTTTTT Oligo dT引物 RNA－ DNA雜交分子 mRNA cDNA合成法 合成 6～ 10個核苷酸長的寡核苷酸短片段，作 為合成第一鏈 cDNA的引物。 隨機引物 可用于合成特長的 mRNA分子 5’ mRNA 3’ 用 堿 處理 或用 RNaseH降解 mRNADNA雜交分 子中的 mRNA。 mRNA cDNA 3’ 3’ 5’ 5’ 反轉(zhuǎn)錄酶 引物 mRNA cDNA第一 鏈 3’ 3’ 5’ 5’ 引物 cDNA第一鏈 3’ 5’ 引物 ② 降解 mRNA模板 RNaseH 剩下的 cDNA單鏈的 3’末端一般形成一個 彎回來的雙鏈發(fā)卡結(jié)構(gòu) （機理不明），可成為合成第二條cDNA鏈的引物。用 DNA聚合酶合成第二鏈 DNA。 cDNA第一 鏈 5’ cDNA第二鏈合成 DNA聚合 酶 cDNA第一 鏈 cDNA第二 鏈 5’ 3’ ③ cDNA第二鏈合成 自我引導(dǎo)合成法 ④ 去掉發(fā)卡結(jié)構(gòu) 核酸酶 S1 用 核酸酶 S1可以切掉發(fā)卡結(jié)構(gòu)（這會導(dǎo)致cDNA中有用的序列被切掉！）。 cDNA第一 鏈 cDNA第二 鏈 5’ 3’ cDNA第一 鏈 cDNA第二 鏈 5’ 3’ 5’ 3’ 這種酶能識別 mRNAcDNA雜交分子中的 mRNA，并將其降解成許多 小片斷 。 妙用 RNaseH（置換合成法） 小片斷正好成為 DNA聚合酶的引物，用來合成岡崎片斷 。 優(yōu)點： a）合成 cDNA的效率高 b）直接利用第一鏈的反應(yīng)產(chǎn)物，不需純化 c）避免使用 S1核酸酶來切割雙鏈 cDNA mRNA cDNA 3’ 5’ 反轉(zhuǎn)錄酶 引物 mRNA cDNA第一鏈 3’ 5’ 引物 mRNA cDNA第一鏈 3’ 5’ mRNA mRNA DNA 聚合酶 DNA 聚合酶 cDNA第二鏈 cDNA第一鏈 3’ 5’ RNaseH DNA ligase 去引物 在雙鏈 cDNA末端接上 人工接頭 ，即可與載體連接，轉(zhuǎn)入受體菌。 或借助末端轉(zhuǎn)移酶給載體和雙鏈 cDNA的 3’端分別加上幾個 C或 G，成為粘性末端。 （ 4） cDNA與載體連接： 接上人工接頭 粘性末端 CCC CCC 末端轉(zhuǎn)移酶 4. cDNA文庫的大小 一個 cDNA文庫要包含 99%的 mRNA時所需要的克隆數(shù)目。 : 某一種低豐度（不足 14份拷貝） mRNA占細(xì)胞整個 mRNA的比例 N= ln (1p) ln (1 ) 1 n P : 文庫包含了完整 mRNA的概率（ 99%） N :所需的重組載體數(shù)（克隆數(shù)） 1 n cDNA文庫構(gòu)建的實例 三、 cDNA和基因組文庫的區(qū)別 Genome DNA library 基因組 DNA 生物體的每個 gene有一個 clone cDNA library mRNA 只包含生物體特定組織、特定發(fā)育階段表達的 gene 出發(fā)材料： 所包含 gene: （一
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