t載體與目的基因連接(編輯修改稿)
2024-09-12 23:57 本頁(yè)面
【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 水定容至1ml，貯存于20℃。 LB培養(yǎng)基： 配制每升培養(yǎng)基,應(yīng)該在950 ml去離子水中加入:胰化蛋白胨 10g 酵母提取物 5g NaCl 10g （ ） ?。? Amp（100mg/ml）：，最后定容至1ml，. 實(shí)驗(yàn)過(guò)程（一）.目的基因片段與載體連接 器材 旋渦混合器，微量移液取樣器，移液器吸頭， 微量離心管，雙面離心管架，臺(tái)式離心機(jī)，干式恒溫氣浴。 試劑 T 載體，T4 DNA 連接酶，連接酶緩沖液，無(wú)菌dd Water ?！ 〔僮鞑襟E PCR產(chǎn)物與T載體直接連接： （1） 事先將干式恒溫儀（或冰盒里的水）溫度設(shè)定在14~16176。C。 （2） 取4個(gè)滅菌的200ul微量離心管，加入：（需要調(diào)整） 4ml 目的基因 ；1ml T載體 ； T4 DNA連接酶（TAKARA, 350U/ul）；1ml 連接酶緩沖液10 x buffer ； ml dd Water ，總量10ml 體系。 ?。?） 述混合液輕輕震蕩后再短暫離心，然后置于14176。C干式恒溫儀（或14176。C水中）中保溫過(guò)夜（1216h）。 ?。?） 連接后的產(chǎn)物可以立即用來(lái)轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞或置4176。C冰箱備用。 （二）. 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備細(xì)菌轉(zhuǎn)化 儀器：旋渦混合器，微量移液取樣器，移液器吸頭，50ml 微量離心管， 微量離心管，臺(tái)式冷凍離心機(jī)，制冰機(jī)，恒溫?fù)u床，分光光度計(jì)，超凈工作臺(tái)，恒溫培養(yǎng)箱，搖菌試管，三角燒瓶，接種環(huán)，恒溫?fù)u床，培養(yǎng)皿（已鋪好固體LBAmp），酒精燈，玻璃涂棒，恒溫培養(yǎng)箱，濾膜和過(guò)濾器 試劑： E. coli菌種，LB培養(yǎng)基， mol/L CaCl2溶液，無(wú)菌dd Water ，LB培養(yǎng)基（不加抗菌素），LB培養(yǎng)基（加抗菌素），無(wú)菌dd water，IPTG，Xgal。 步驟（1） 在超凈工作臺(tái)中，將1ml大腸桿菌菌液加入100ml LB液態(tài)培養(yǎng)基（不含抗菌素），37℃搖床培養(yǎng)過(guò)夜。 ?。?） LB培養(yǎng)基的三角燒瓶中，37℃下250r/min搖床培養(yǎng)2~3h，~（~，細(xì)胞數(shù)108/mL，此為關(guān)鍵參數(shù)！）。（注意：此步搖菌的時(shí)候，要有一管不加菌的LB培養(yǎng)液同時(shí)搖菌） ?。?） ，于冰上放置10min，然后
高考資料相關(guān)推薦
鄂ICP備17016276號(hào)-1