目的基因獲得ppt課件(編輯修改稿)
2025-05-26 03:16 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 載體，一般選擇質(zhì)粒或 λ DNA，受體細胞一般選擇大腸桿菌。 ? 如果 轉(zhuǎn)化子采用菌落原位雜交法或限制性酶切圖譜法篩選，則選擇多拷貝克隆載體。 ? 如果轉(zhuǎn)化子采用基因產(chǎn)物功能檢測法篩選，則選擇表達型載體，受體細胞選擇能使目的基因表達的受體細胞。 ? 抗生素抗性篩選 ? 蘭 白斑篩選 ? PCR篩選 ? DNA雜交篩選 鳥槍法克隆目的基因的局限性 ? 工作量較大，需要了解目的基因的背景知識 ? 不能獲得的最小長度的目的基因 ? 不能除去真核生物目的基因的內(nèi)含子結(jié)構(gòu) cDNA文庫的構(gòu)建及目的基因的獲得 cDNA文庫的構(gòu)建 （ 1）分離提取細胞總 RNA （ 2） mRNA與其他 RNA的分離， mRNA僅占總 RNA的 1~2%，可利用 mRNApoly(A)與其他 RNA分開。 mRNA與其他 RNA的分離 (3) 以 mRNA為模板反轉(zhuǎn)錄合成 cDNA的第一條鏈 ? mRNA純化后，加入 oligo(dT)作為引物，以提供 3’OH引導(dǎo) DNA鏈的合成， 同時加入逆轉(zhuǎn)錄酶和四種 dNTP，形成 RNADNA雜合分子。 ? 以 mRNA為模板反轉(zhuǎn)錄合成 cDNA的第一條鏈 （ 4） cDNA第二鏈的合成 自身引導(dǎo)法 獲得的雙鏈 cDNA 5’端會有幾對堿基缺失 （ 4） cDNA第二鏈的合成 置換合成法 獲得的雙鏈 cDNA 5’端也會有幾對堿基缺失 ,還會有一小段 RNA,但不影響后續(xù)的克隆操作。 cDNA第二鏈的合成 引導(dǎo)合成法 獲得的雙鏈 cDNA 能保留完整的 5’端序列 cDNA法克隆目的基因的基本戰(zhàn)略 （ 5）雙鏈 cDNA的克隆 ? 平頭末端直接與載體連接，但插入的片段無法回收 ? 加裝人工接頭
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