基礎學習實驗-8-目的基因的pcr擴增及其擴增產物的鑒定(編輯修改稿)
2025-09-11 21:25 本頁面
【文章內容簡介】 GAAATCAGGAACATCTCTTTCAATGACAAAAAGTTTGTCATTAAACCCATCGACAAGAAGGCACCTGACTT TGTGTTTTATGCCCCACGTCTGAGAATCAACAAGCGGATCCTGCAGCTCTGCATGGGCAACCATGAGTTGTATATGCGCC GCAGGAAGCCTGACACCATCGAGGTGCAGCAGATGAAGGCCCAGGCCCGGGAGGAGAAGCATCAGAAGCAGCTGGAGCGG CAACAGCTGGAAACAGAGAAGAAAAGGAGAGAAACCGTGGAGAGAGAGAAAGAGCAGATGATGCGCGAGAAGGAGGAGTT GATGCTGCGGCTGCAGGACTATGAGGAGAAGACAAAGAAGGCAGAGAGAGAGCTCTCGGAGCAGATTCAGAGGGCCCTGC AGCTGGAGGAGGAGAGGAAGCGGGCACAGGAGGAGGCCGAGCGCCTAGAGGCTGACCGTATGGCTGCACTGCGGGCTAAG GAGGAGCTGGAGAGACAGGCGGTGGATCAGATAAAGAGCCAGGAGCAGCTGGCTGCGGAGCTTGCAGAATACACTGCCAA GATTGCCCTCCTGGAAGAGGCGCGGAGGCGCAAGGAGGATGAAGTTGAAGAGTGGCAGCACAGGGCCAAAGAAGCCCAGG ATGACCTGGTGAAGACCAAGGAGGAGCTGCACCTGGTGATGACAGCACCCCCGCCCCCACCACCCCCCGTGTACGAGCCG GTGAGCTACCATGTCCAGGAGAGCTTGCAGGATGAGGGCGCAGAGCCCACGGGCTACAGCGCGGAGCTGTCTAGTGAGGG CATCCGGGATGACCGCAATGAGGAGAAGCGCATCACTGAGGCAGAGAAGAACGAGCGTGTGCAGCGGCAGCTGCTGACGC TGAGCAGCGAGCTGTCCCAGGCCCGAGATGAGAATAAGAGGACCCACAATGACATCATCCACAACGAGAACATGAGGCAA GGCCGGGACAAGTACAAGACGCTGCGGCAGATCCGGCAGGGCAACACCAAGCAGCGCATCGACGAGTTCGAGGCCCTGTAA Ezrin的編碼區(qū)序列 Ezrin蛋白含有四個功能域 名稱 起始 終點 功能 FERM_N 9 86 將胞漿蛋白連接到膜上 FERM_M 88 206 FERM_C 210 299 ERM 338 586 結合胞漿蛋白 我們課題組發(fā)現 Ezrin在食管癌及切緣食管粘膜組織中的位置分布有胞膜分布、胞漿分布和胞膜胞漿混合分布等三種模式。惡性程度越高的癌細胞越易具有胞漿分布模式，說明 Ezrin細胞定位的變化可能在食管癌的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。 第二部分， PCR引物設計 引物決定了 PCR產物的長度和特異性。目前有多種引物設計軟件，如 primer premierOligo和北京軍事醫(yī)學科學院李伍舉教授開發(fā)的 Biosun等， Inter免費引物設計網站有primer 3， Primerfinder等。 引物設計有以下幾個原則： （ 1）引物的特異性。引物應根據目的序列進行設計，引物與非靶序列之間不要超過 70％的同源性或連續(xù) 8個的堿基互補，減少非特異產物； （ 2）引物的長度。一般指引物中能與模板序列互補結合的部分，不包括在 5‘端額外增加的酶切位點序列和其他序列。引物長度以 18～ 24 bp為佳。 （ 3）引物 3?末端的堿基。引物 3?末端是延伸的始端，堿基錯配會影響延伸效率。當最后一個堿基是 A時，容易發(fā)生錯配，所以引物 3?末端最好不要為 A； （ 4）引物的 G+C含量一般為 40％～ 60％，過高或過低都不利于引發(fā)反應； （ 5）兩條引物不能形成穩(wěn)定的二聚體，或引物自身不能形成穩(wěn)定的二級發(fā)夾結構，這些都會影響引物與模板的結合。 （ 6）兩條引物的融解溫度 Tm值盡量不要相差太大，引物的 Tm值粗略計算公式為 Tm = 4 （ G+C） +2（ A+T）； （ 7）引物的 539。端對擴增特異性沒有影響，因此可以被修飾而不影響擴增的特異性，引物 5′端修飾包括加酶切位點、標記生物素和熒光等，引物 339。端是延伸的開始，不能進行任何修飾。 引物設計軟件 primer premier 可通過兩個方法將序列輸入軟件中 在表中粘貼序列 打開原有的序列文件 選擇序列文件所在位置 ? 在對話框中輸入待擴增序列 ? 點擊左上角的“ Primer”按鈕 ? Hairpin: 引物自身是否會形成發(fā)夾結構 ? Dimer: 同一種引物是否會形成二聚體 ? False primiring: 引物在待擴增序列中其他位置是否有配對 ? Cross Dimer: 正向與反向引物間是否會形成二聚體 引物設計界面 正向和反向引物的互換 正向和反向引物的評價 正向和反向引物的信息 每點擊左邊紅色的按鈕，就出現相應的內容 對正向和反向引物進行編輯 可對引物進行增加或減少堿基 用鍵盤輸入了 5個堿基 引物的信息 改動后引物的信息 重新回到雙引物的界面 “Edit”－“ Copy”－“ Sense Primer” 539。 CGCCTCGAGAAAAGACAGGACTCCACCTCA 339。 輸出引物序列 ? 了解并掌握 PCR基因擴增的基本原理 ? 熟悉 PCR基因擴增技術的具體操作過程 實驗目的 第三部分， PCR實驗操作 一、概述 ? PCR：使用一對寡核苷酸引物，以目的序列為模板，利用 DNA合成 酶和四種脫氧核糖核酸進行 DNA的體
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