產(chǎn)植酸酶黑曲霉菌株s8-的基因擴(kuò)增與鑒定(編輯修改稿)
2024-08-31 13:31 本頁(yè)面
【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 h，溴化乙錠染色后在凝膠成像系統(tǒng)里觀察、分析回收的質(zhì)量和數(shù)量。⒈⒉⒐植酸酶基因的酶切圖譜分析鑒定根據(jù)對(duì)基因庫(kù)下載的黑曲霉植酸酶 phyA 基因序列的酶切位點(diǎn)分析和大量資料報(bào)道，植酸酶基因不含 HindⅢ、XbaⅠ、KPn Ⅰ等酶切位點(diǎn)，含有 BamHⅠ、SalⅠ等酶切位點(diǎn)，用相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶對(duì)經(jīng)純化的 PCR 產(chǎn)物進(jìn)行酶切圖譜分析和鑒定，酶切產(chǎn)物、phyA 純化產(chǎn)物、標(biāo)準(zhǔn)分子量各3 5μL 同時(shí)在 %瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳， 80v2h 毛孔大怎么辦，溴化乙錠染色后在凝膠成像系統(tǒng)上分析，以進(jìn)一步判斷是否為黑曲霉植酸酶 phyA 基因。⒉結(jié)果⒉⒈ 從黑曲霉孢子中提取染色體 DNA用三種不同方法提取的黑曲霉基因組 DNA，電泳結(jié)果為泛特津（Vitagene）試劑盒法提取的DNA 產(chǎn)出率較高，純度也較好，1g 濕菌體能提取約 50μ g 的 DNA；與標(biāo)準(zhǔn)的 Maker15,000 對(duì)比，植酸酶基因組的分子量大于 ， 如圖 1 所示。1 2 3 4 試劑盒提取的霉菌總 DNA DNA 2 PCR 產(chǎn)物 3 PCR 產(chǎn)物 圖 DNA 提取的 agarose 電泳 圖 2. PCR PhyA 產(chǎn)物的 agarose 電泳 result of electroresis offungus gross DNA the result of electroresis of production of PCR PhyA⒉⒉ PCR 體系的優(yōu)化結(jié)果梯度 PCR 結(jié)果最佳的反應(yīng)體系是： MgCl 2 、Primer1 、 Primer2 、4dNTPmixture 、TaqDNA 聚合酶 (預(yù)變性后加)、H 2O ，反應(yīng)總體積 。最適 PCR 反應(yīng)程序：94℃ 預(yù)變性 3min，65℃暫停 2min 加TaqDNA 聚合酶； 94℃變性 1min，56℃退火 1min，72℃延伸 2min，33 個(gè)循環(huán)后 72℃再延伸10min。⒉⒊三對(duì)引物的 PCR 擴(kuò)增結(jié)果根據(jù)最適 PCR 條件建立 phyA PCR 反應(yīng)體系，用同一模板不同引物進(jìn)行 phyA 基因的 PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)果如圖 2 所示：植酸酶基因 PCR 擴(kuò)增出來(lái)的目的基因片段在 1000~2500bp 之間，約1500bp 左右，可初步判定為黑曲霉植酸酶 phyA 基因。⒉⒋目的基因的回收純化結(jié)果用三種不同的方法回收 PhyA 目的基因片段，其中 PCR Fragment Recovery Kit 法回收的質(zhì)量和數(shù)量最好，約 50ng/5μl，其它兩種方法回收數(shù)量無(wú)，如圖 3 所示：⒉⒌ 目的片段的酶切分析鑒定 結(jié)果見(jiàn)圖 4 所示。 product/HindⅢ product/Xba PhyA 目的基因 product/KPnⅠ product/BamH 1 回收的 PhyA 目的基因 product/SalⅠ product 2 回收的 PhyA 目的基因 Maker 圖 3. PhyA 目的基因回
黨政相關(guān)相關(guān)推薦
鄂ICP備17016276號(hào)-1