【文章內(nèi)容簡介】 學(xué)技術(shù)進(jìn)步的產(chǎn)物，以效率和創(chuàng)造性為標(biāo)志的新紀(jì)元，在一連串各自發(fā)中，為科學(xué)和商業(yè)提供了聲望和商機，在科學(xué)進(jìn)展于新產(chǎn)品開發(fā)和衛(wèi)生保健行業(yè)發(fā)展新開傳奇直接掛鉤這個投資氛圍下，分子生物學(xué)在美國蓬勃發(fā)展起來，也產(chǎn)生了孕育 PCR 技術(shù)的大環(huán)境：(1) “重組工程”或統(tǒng)稱為“操作”其他分子技術(shù)的重大突破(2) 具備了鼓勵科研成果快速向應(yīng)用問題轉(zhuǎn)化的法規(guī)環(huán)境，修訂了積極推動科學(xué)界和工業(yè)界將發(fā)明創(chuàng)造商業(yè)化的專利法(3) 政府資助的研究與尋求投資的風(fēng)險資本密切結(jié)合，為分子生物學(xué)研究和開發(fā)奠定了雄厚的基礎(chǔ)。b. PCR 思想與技術(shù)產(chǎn)生過程：(1) PCR 思想的醞釀期：1979 年穆利斯為 DNA 合成實驗室主任，主要任務(wù)加速和優(yōu)化寡核苷酸合，穆利斯嘗試修改化合途徑的參數(shù)，發(fā)現(xiàn)人們對聊執(zhí)的變形和復(fù)性過程知之甚少，他首次研究 DNA 變性的溫度與時間關(guān)系，希望通過一系列計算機程序，來預(yù)測某個特定序列的解鏈溫度，經(jīng)過實驗認(rèn)為溫度變化的速率對堿基之間的結(jié)合、分解幾乎沒什么影響，結(jié)論是單鏈寡核苷酸很快就能結(jié)合成雙鍵。當(dāng)時，一家名為生物研究的公司制造出了第一臺合成 DI、JA的原型樣機，穆利斯的朋友多肽化學(xué)家?guī)炜藶樗崃艘慌_樣機，雖這機器不很成功，但可節(jié)約大量時間，把平時一個月的工作壓縮到一天完成，穆利斯對這臺機器改進(jìn)提出了許多建議，他熱衷于編寫新程序，有了這臺儀器他的實驗室成了生物技術(shù)界最早實現(xiàn) Dl、IA 合成儀自動化的單位之一，工作效率的提高，穆刺斯把更多的時間用在計算機上，穆利斯逐漸被計算機程序的“循環(huán)” 的迭代過程所吸引，這個理論對生化學(xué)家是新奇的，他們很少考慮為什么要再而三的重復(fù)某個過程，所以無論公司還是在家他都擺弄迭代問題，這為他開始思考指數(shù)擴增問題一 PCR 理論中關(guān)鍵部分做到了思想基墊。穆利斯用少量的目標(biāo)來鑒定高度復(fù)雜的目標(biāo)的特定序列，思緒終于ⅨqA 聚合酶和 DNA 測序聯(lián)系到了一起?！　?2) PCR 實驗摸索期：1983 年 9 月 8 日所進(jìn)行第一次 PCR 的實驗，穆利斯選擇了人神經(jīng)生長因子基因作為目標(biāo)序列，試驗結(jié)論沒證明也沒推翻 PCR 的所有理論。10 月進(jìn)行“PCR02”號實驗將第一次實驗改為 5 到 10 個循環(huán)分步加熱反應(yīng)冷卻后再加聚合酶括延模板，但結(jié)果仍失敗，后兩個月他試圖集中精力解決一些老問題，12 月他開始用不同限制酶處理 DNA 模板，希望建立測定高溫條件下核苷酸用量及凝膠檢測最佳效果的定量關(guān)系。穆利斯換了一個容易得到較為簡單的 pBR322 質(zhì)粒作為模板，此細(xì)菌 E 小姨的擴增比人 DNA 容易得到而且選擇了很小的模板 Dl 蛆段，又進(jìn)一步減少反應(yīng)體積，增高反應(yīng)成分濃眨，復(fù)興溫度降到 320C，在 10 次循環(huán)后停止反應(yīng)，實驗結(jié)果是 PCR 確實產(chǎn)生了一個條帶但太淺不顯著。為了取得更高靈敏度試著增加了幾個加熱和冷卻循環(huán)，最后一個加入了放射性示蹤物(dcrP)，這次實驗進(jìn)步很大。激動不已繁榮穆利斯把當(dāng)時西特斯唯一專利法律師阿綠安拽到暗室讓他檢查放射自顯影圖，沒有對照實驗，結(jié)果不很清晰但確實有條帶?！　?3) PcR 技術(shù)的成型期：1984 年 6 月西特斯公司懷特決定，免去穆利斯DNA 合成實驗室主任現(xiàn)他在一定時間內(nèi)把 PCR 這個課題做好，他為穆利斯制定明確目標(biāo)和工作時間表，懷特建議厄利克和安海姆組建“PCR 組” ，日常工作由厄利克和安海姆共同負(fù)責(zé)，并建議用人類基因組功姐做模板。PCR 組成人員不但互相交流實驗數(shù)據(jù)而且樂意聽取建設(shè)性意見，提出各種旨在早日完成任務(wù)的實驗策略。1984 年 11 月 15 日實驗在全組人員共同努力下 PCR 擴增得到了分子量與期望值完全相符合的產(chǎn)物，至此 PCIR 奏效已確造無疑。但以后幾個月繼續(xù)做了許多，一些成功一些失敗，1984 年冬到 1985 年春，研究組認(rèn)為結(jié)果令人鼓舞，但不十分確定，這時，厄利克合安海姆決定讓公司技藝精湛的實驗技術(shù)師才木完全投身 PCR 組工作，事實證明這是一個非常有眼光的決定，因為有關(guān) PCR 的一篇論文中幾乎所有工作者都是才木親手完成的。1985 年 3 月28 日公司申請了有關(guān) PCR 的第一個專利。 PCR 技術(shù)的原理 PCR 由變性 退火延伸三個基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：　　a. 模板 DNA 的變性：模板 DNA 經(jīng)加熱至 93℃左右一定時間后，使用模板 DNA 雙鏈或經(jīng) PCR 擴增形成的雙鏈 DNA 解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作好準(zhǔn)備。 b. 模板 DNA 與引物的退火(復(fù)性)：模板 DNA 經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至 55℃左右，引物與模板 DNA 單鏈的互補序列配對結(jié)合； c. 引物的延伸：DNA 模板引物結(jié)合物在 TaqDNA 聚合酶的作用下，以dNTP 為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板 DNA 鏈互補的半保留復(fù)制鏈重復(fù)循環(huán)變性退火延伸三過程，就可獲得更多的“ 半保留復(fù)制鏈 ”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個循環(huán)需 2～4 分鐘， 2～3 小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。 到達(dá)平臺期所需循環(huán)次數(shù)取決于樣品中模板的拷貝。 PCR 技術(shù)的應(yīng)用(1) 不對稱 PCR 制備單鏈 DNA 用于 DNA 測序；(2) 反向 PCR 測定未知 DNA 區(qū)域 ；? (3) 反轉(zhuǎn)錄 PCR（RT核酸的基礎(chǔ)研究：基因組克隆；? (4) PCR 用于檢測細(xì)胞中基因表達(dá)水平、RNA 病毒量以及直接克隆特定基因的 cDNA； ? (5) 熒光定量 PCR 用于對 PCR 產(chǎn)物實時監(jiān)控； ? (6) cDNA 末端快速擴增技術(shù)； ? (7) 檢測基因的表達(dá)；? (8) 醫(yī)學(xué)應(yīng)用：檢測細(xì)菌、病毒類疾??；診斷遺傳疾??；診斷腫瘤；應(yīng)用于法醫(yī)物證。 硬件總體構(gòu)架方案溫度控制是一類具有滯后性的控制系，所以在設(shè)計儀器的硬件控制系統(tǒng)系統(tǒng)時就要考慮到采用一些集成性提較高體積小同時性價比較好的元件。在任何精密電子儀器的硬件系統(tǒng)開發(fā)設(shè)計當(dāng)中，都有一定的基礎(chǔ)原則：(1) 穩(wěn)定性和可靠性。這是每個控制系統(tǒng)都首要保證的，在硬件方面體現(xiàn)在選擇適當(dāng)?shù)脑愋?，采取抗干擾措施防止誤差積累。(2) 速度與精度。按系統(tǒng)要求誤差分配各個部件模塊所允許的誤差，盡量選擇同等價位的高精度元件。(3) 功耗。采用低功率器件并合理設(shè)計功率電路，減小制版面積，提高電路本身的抗干擾性能。根據(jù)以上原則，PCR 儀硬件溫度控制系統(tǒng)的總體設(shè)計框圖如圖 所示。鍵 盤LCD顯示核 心芯 片STM32101R8T6輸 出 電路A/D加 熱 制冷 技 術(shù)溫 度 檢測 電 路驅(qū) 動 電路信 號 放大 電 路功 率 放大 電 路變 溫 室 圖 溫度控制系統(tǒng)硬件總體框圖如圖 所示，組成溫控系統(tǒng)的各部分分別為：(1) 單片機控制核心 STM32 芯片。是包括主要控制單元單片機及外圍電路在內(nèi)的溫控系統(tǒng)的核心，這部分負(fù)責(zé)通過控制程序計算輸入輸出數(shù)據(jù)，控制AD 輸入和 PWM 輸出； (2) 顯示與輸入鍵盤。LCD 和鍵盤接口電路構(gòu)成的監(jiān)控部分，作為系統(tǒng)控制所需的主要的參數(shù)輸入和實驗過程監(jiān)控顯示設(shè)備； (3) 溫度檢測電路。由不平衡電路和鉑電阻 PT100 構(gòu)成的溫度檢測電路將采集到的溫度變化信號模擬量經(jīng)單片機內(nèi) A/D 轉(zhuǎn)換后參與系統(tǒng)參數(shù)運算； (4) 功率驅(qū)動電路。是由 BTL 橋式放大電路及半導(dǎo)體制冷器件構(gòu)成的溫度控制電路，單片機將計算后得到的控制量以 PWM 的形式輸出到功率驅(qū)動電路，控制半導(dǎo)體制冷設(shè)備的加熱制冷，達(dá)到最終控制基因擴增變化過程的目的。3 PCR 儀溫度控制硬件設(shè)計 系統(tǒng)的構(gòu)成和工作原理基因擴增技術(shù)關(guān)鍵的環(huán)節(jié)就是溫度的控制，準(zhǔn)確的溫度就可以使 PCR 實驗順利的進(jìn)行。所以如何精確控制 PCR 儀的溫度控制系統(tǒng)溫度變化的速度和溫度保持的穩(wěn)定性就成為設(shè)計基因擴增儀器的重點。本章首先介紹基因擴增儀溫度控制系統(tǒng)的整體結(jié)構(gòu)和系統(tǒng)的功能特點，然后闡述系統(tǒng)的控制方式，最后介紹系統(tǒng)的基本工作原理。 系統(tǒng)的整體結(jié)構(gòu)和功能特點a. 系統(tǒng)的整體結(jié)構(gòu)：本次基因擴增儀溫度控制系統(tǒng)的整體控制是采用軟件控制和硬件控制相結(jié)合的方式，具體方法就是首先在上位機編寫控制程序和鍵盤及顯示器的操作程序，然后將程序下載到單片機，同時又可以在通過通訊口連接計算機兩種方法，實現(xiàn)離線和在線都可以控制的方法，使儀器的控制快捷，多樣化。采用基于單片機控制系統(tǒng)外圍電路、輸出功率驅(qū)動控制電路、溫度檢測電路、由液晶顯示器和鍵盤構(gòu)成的監(jiān)控部分電路的實時控制。 b. 系統(tǒng)的功能特點：溫度的精度測量和精準(zhǔn)控制對于一個系統(tǒng)是十分重要的，比如許多實驗反應(yīng)都需要保持在特定的溫度下進(jìn)行，不同溫度下物質(zhì)反映的性質(zhì)不同，而且往往一個實驗在不同階段需要不同的反應(yīng)溫度，所以溫度控制能否做到精度高，穩(wěn)定性好，速度快，系統(tǒng)易升級等是比較關(guān)鍵的。本文涉及的基于單片機控制半導(dǎo)體制冷技術(shù)的基因擴增儀的溫度控制系統(tǒng)就力求做到以上幾項性能要求。從硬件角度，本次設(shè)計當(dāng)中的溫度檢測電路是在融匯了電子線路書籍中所教授的橋式電路的思想后原創(chuàng)的信號變換電路，將 0 到 100 攝氏度的溫度信號轉(zhuǎn)換為 0 到 的電壓信號。并且將以往人員所研究的功率驅(qū)動電路經(jīng)改進(jìn)式才重設(shè)計，去掉多余電路采用精確控制電路，使控制電路更易實現(xiàn)。 溫度控制系統(tǒng)的工作原理a. 溫度控制系統(tǒng)：人類對溫度從認(rèn)知到測量再到控制已經(jīng)經(jīng)歷了很長的發(fā)展過程，人類現(xiàn)如今的生活已經(jīng)離不開溫度控制，小到生活中的家用電器、醫(yī)療儀器，大到軍事領(lǐng)域設(shè)計導(dǎo)彈制導(dǎo)，都涉及到溫度控制?？刂葡到y(tǒng)分為開環(huán)控制系統(tǒng)和閉環(huán)控制系統(tǒng)。開環(huán)控制系統(tǒng)： 只有正向作用存在于控制器與控制目標(biāo)之間的系統(tǒng)叫做開環(huán)控制系統(tǒng)。開環(huán)控制的輸入和輸出之間沒有反向聯(lián)系，是一種單向的控制過程。開環(huán)控制系統(tǒng)結(jié)構(gòu)簡單，容易調(diào)試。參與控制的信號來自于兩條通道：干擾和制控量。 一般開環(huán)系統(tǒng)只適合在參數(shù)穩(wěn)定，無強噪聲的系統(tǒng)中使用。開環(huán)制空基本框圖如圖 所示。 干擾給定值 被控量 圖 開環(huán)控制系統(tǒng)方框圖閉環(huán)反饋控制： 閉環(huán)控制系統(tǒng)是利用系統(tǒng)輸出的偏差反饋至系統(tǒng)輸入端與輸入端一同作用于控制器，其系統(tǒng)框圖如圖 所示。這種控制方法比開環(huán)控制系統(tǒng)更具有實現(xiàn)高精度控制的可能性。 干擾 給定值 被控量 圖 閉環(huán)反饋控制系統(tǒng)方框圖 溫度控制系統(tǒng)可以按照以上兩種控制系統(tǒng)分析，為了取得最優(yōu)的控制精度，本設(shè)計中采用第二中方法，將輸出和輸入值的誤差作為反饋信號，與輸入值差值后得到最終輸出的控制量作用于執(zhí)行器。b. 系統(tǒng)的工作原理：基因擴增儀是實現(xiàn)基因擴增過程中變性復(fù)性延伸三個變化階段的主要工具和手段，所以 PCR 儀的工作原理就圍繞這三個變化階段進(jìn)行溫度控制。這三個主要變溫過程主要包括基因鏈變性分解所需的溫度是 8095 攝氏度，單鏈結(jié)合要求的溫度是 50 攝氏度左右，雙鏈延伸的溫度是 75 攝氏度左右。標(biāo)準(zhǔn)的PCR過程分為三步：(1) DNA變性 (90℃一96℃)：雙鏈DNA模板在熱作用下，氫鍵斷裂，形成單 計算 執(zhí)行 受控對象比較和計算 執(zhí)行 受控對象測量鏈DNA。(2) 退火(25℃一65℃)：系統(tǒng)溫度降低，引物與 DNA模板結(jié)合，形成局部雙鏈。(3) 延伸(70℃一75℃)：在 Taq酶(在72℃左右最佳的活性)的作用下，以dNTP為原料，從引物到延伸，合成與模板互補的 DNA鏈。每一循環(huán)經(jīng)過變性、退火和延伸，DNA含量即增加一倍。 所以根據(jù) DNA 復(fù)制過程得到的 PCR 實驗過程如圖 4 循環(huán) 100 94℃（變性） 加熱 72℃（延伸） 溫度 （攝氏 50 度） 54℃（退火） 30 50 90 加熱時間 t/s圖 . PCR 擴增溫度循環(huán)曲線 要使基因按照人們希望的數(shù)量和規(guī)則去擴增，首先就需要提供基因正確變化的溫度，因為基因是活性物質(zhì)所以對溫度有著高度的依賴性?；驍U增儀的基本工作原理，也就是通過控制基因擴增儀內(nèi)部的溫度變化來實現(xiàn)的。 儀器的系統(tǒng)環(huán)境溫度變化從室溫到 100℃范圍較大，升降溫度要求較快，并且作為科學(xué)研究儀器它在溫度穩(wěn)定階段要求精度也較高。要得到能夠進(jìn)行研究的樣品量，則需要將樣品復(fù)制 30 次左右，而每次系統(tǒng)恒溫保持階段時間不會低于 30 秒，再加上變溫時間，所以一個循環(huán)階段循環(huán) 30 次以上，則理論上一次 PCR 至少需要一個小時以上，同時不僅要盡量縮短系統(tǒng)升降溫過程的時間，而且要避免超調(diào)量太大，以免