【正文】 放射性抗體測定法的操作過程 ? 首先將轉(zhuǎn)化的菌體涂布在瓊脂平板培養(yǎng)基上，長出菌落后，再影印到另一塊瓊脂平板上培養(yǎng)。 ? 根據(jù)實驗手段的不同，免疫學(xué)檢測法可以分為 抗體測定法 和 免疫沉淀測定法 等類型。 生物素標(biāo)記探針 （光敏基團） 將光敏生物素與待標(biāo)記的核酸混合，在一定條件下強光照射約15min使光敏生物素與核酸間形成牢固的共價結(jié)合，從而得到生物素標(biāo)記的核酸探針。 ? ④ PCR標(biāo)記法 (PCR labeling)：標(biāo)記的一種 dNTP ? ⑤ 光敏標(biāo)記法 ? ⑥化學(xué)衍生結(jié)合標(biāo)記法 ： 生物素和地高辛等非放射性標(biāo)記物可以與事先經(jīng)過化學(xué)修飾得到的核酸衍生物更加牢固地結(jié)合，進(jìn)行非放射性探針的制備。與切口平移法不同的是，該方法標(biāo)記的是模板互補鏈，而非模板本身。酶法應(yīng)用廣泛，適于制備所有放射性標(biāo)記探針及部分非放射性標(biāo)記探針。 體外標(biāo)記 ? 包括化學(xué)法和酶法兩種。熒光素標(biāo)記探針可通過熒光顯微鏡觀察檢出，或通過免疫組織化學(xué)法來檢測。 ? 該配基通過一個由 11個碳原子組成的連接臂與尿嘧啶核苷酸嘧啶環(huán)上的第 5個碳原子相連，形成地高辛標(biāo)記的尿嘧啶核苷酸。生物素標(biāo)記的探針可通過 生物素 抗生物素蛋白的親和系統(tǒng) 檢出，也可以通過 生物素 抗生物素抗體的免疫系統(tǒng) 檢出。 生物素 (biotin) ? 生物素 是一種水溶性維生素．又稱為 維生素 H、輔酶 R（羧基轉(zhuǎn)化酶的輔酶） 。 ? 標(biāo)記物放射性的檢測主要使用蓋革計數(shù)器和液體閃爍計數(shù)器等射線探測儀來完成。 ? 與 32P標(biāo)記物相比， 35S的放射性較弱，檢測靈敏度低，但其分辨力高，放射自顯影的本底低，適于細(xì)胞原位雜交等。 （ 2）探針標(biāo)記物 ? 理想的探針標(biāo)記物應(yīng)滿足的條件 ： ? 1)標(biāo)記物不會影響探針的主要理化性質(zhì)，如雜交特異性、雜交穩(wěn)定性及酶反應(yīng)待征等； ? 2)檢測靈敏度高、特異性強、本底低、重復(fù)性好； ? 3)操作簡便、省時．經(jīng)濟實用： ? 4)化學(xué)穩(wěn)定性高、易于長期保存； ? 5)安全、無環(huán)境污染。 ? 一般用于篩選 cDNA文庫中那些對應(yīng)于低豐度的 mRNA的目的克隆。 ② 總 cDNA探針 ? 總 cDNA探針是利用逆轉(zhuǎn)錄酶的作用，對生物細(xì)胞總的或經(jīng)分離的 Po1y(A)mRNA進(jìn)行示蹤標(biāo)記制備的。 ? 同源探針 主要用于從 cDNA或基因組 DNA文庫中篩選含有目的序列的克隆于以及通過 southern雜交或 Northern雜交等技術(shù)來鑒定或檢測特定的基因序列，進(jìn)行基因定位分析等。 生物素化 DNA＋抗生物素蛋白＋生物素化酶 DNA 酶復(fù)合體 酶分解底物顯色 五、陽性重組體的分析和初步鑒定 克隆基因片段大小的分析 ①快速破碎法 ②煮沸法 直接電泳比較 ③堿裂解 克隆基因的酶切圖譜分析 ①單酶解分析 —— 克隆片段的存在、大小 ②雙酶解分析 —— 定向克隆用 ③多次酶解分析 —— 切下的小片段再酶解 ④部分酶解分析 —— 物理圖譜 克隆基因的順序分析 克隆基因的產(chǎn)物分析 ①分子量 ② N－末端順序 ③ Aa全順序分析 ④生物活性 ⑤等電點 核酸雜交探針 ? 雜交探針，是指具有一定序列的核苷酸片段，它能與互補的核酸序列復(fù)性雜交，并且通過適當(dāng)標(biāo)記進(jìn)行檢測。可檢出不表達(dá)的重組克隆 缺點： A、必須用放射性同位素：污染 昂貴 B、必須對目的基因順序有所了解 噬菌斑雜交方法完全相同預(yù)菌落雜交法，但效率更高，每次平板可容納 20， 000個噬菌斑。 ? 菌落（或噬菌斑）原位雜交已廣泛地用于從基因組 DNA文庫和 cDNA文庫中篩選含目的基因的重組子。 ? 斑點印跡雜交 是把提取的轉(zhuǎn)化子總 DNA直接點樣到用于雜交的膜上，變性處理后再用 DNA探針與其雜交。 兩者的區(qū)別僅在于呈現(xiàn)在雜交濾膜上的核酸樣品分別為圓斑狀和狹線狀。 注意：需在變性條件下電泳，防止 RNA形成二級結(jié)構(gòu)。 Northern印跡雜交 ? Northern印跡雜交是指將 RNA分子變性及電泳分離后、從電泳凝膠轉(zhuǎn)移到固相支持物上進(jìn)行核酸雜交的方法．又稱為 Northern RNA印跡雜交等。 硝酸纖維素濾膜 尼龍膜 ? 現(xiàn)在人們更傾向于使用 尼龍膜 。 Southern雜交 ? 紀(jì)念發(fā)明者 —— Edward Southern （ 1） 提取總 DNA （ 2） 酶解 （ 3） 電泳 （ 4） 轉(zhuǎn)移到濾膜 （ 5） 變性解鏈 （ 6） DNA探針及雜交 （ 7） 洗脫 （ 8） 放射自顯影 （ 9） 比較分析 演示 ? 在印跡技術(shù)中，硝酸纖維素濾膜是目前應(yīng)用最廣的一種固相支持物，但它也存在一些不足之處： ? 第一、硝酸纖維素濾膜是依賴疏水性相互作用結(jié)合 DNA的，這種結(jié)合并不十分牢固。 ? 它是根據(jù) 毛細(xì)管作用 的原理，使在電泳凝膠中分離的 DNA片段轉(zhuǎn)移并結(jié)合在適當(dāng)?shù)臑V膜上，然后通過與已標(biāo)記的單鏈 DNA或 RNA探針的雜交作用以檢測這些被轉(zhuǎn)移的 DNA片段。 分子雜交 ? 核酸雜交：兩種不同來源單鏈 DNA或 RNA相互配對的過程。 核酸分子雜交檢測法 ? 基本原理是：具有一定同源性的兩條核酸(DNA或 RNA)單鏈在適宜的溫度及離子強度等條件下，可按堿基互補配對原則高度特異地復(fù)性形成雙鏈。進(jìn)一步利用在外源 DNA片段上具有識別位點的一種或一種以上的限制性核酸內(nèi)切酶酶解重組質(zhì)粒分子，根據(jù)酶切圖譜分析即可判明插入片段的方向等。 ? 采用限制性核酸內(nèi)切酶分析法不僅可以進(jìn)一步篩選鑒定重組子，且能判斷外源 DNA片段的插入方向及分子質(zhì)量大小等。 ? 分別提取不同轉(zhuǎn)化子的 DNA，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，由于重組 DNA是載體 DNA中插入了外源 DNA片段，其分子量大于載體 DNA分子，在瓊脂糖凝膠板上出現(xiàn)的 DNA帶中，落后的帶是重組 DNA的帶 。 ? 如使用插入型 λ 載體，由于空載的 λDNA 大于包裝下限，所以也能被包裝成噬菌體顆粒并產(chǎn)生噬菌斑，此時篩選重組子可以利用 λ 載體上的篩選標(biāo)記基因，如 lacZ’。如果目的基因產(chǎn)物能降解某些藥物使菌株呈現(xiàn)抗性標(biāo)記，或者基因產(chǎn)物與某些藥物作用是顯顏色反應(yīng)，則可根據(jù)抗性或顏色直接篩選含目的基因的克隆子。 ? 根據(jù)這些特性， Ecogpt基因可以作為哺乳動物基因轉(zhuǎn)移的一種顯性選擇記號。 ③ 黃嘌呤 鳥嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(XGPRT)基因 ? XGPRT是由大腸桿菌 Ecogpt基因編碼的一種核苷酸代謝酶。 ② 二氫葉酸還原酶基因 ? 二氫葉酸還原酶 (DHFR)在真核細(xì)胞核苷酸生物合成過程中可催化二氫葉酸 (DHF)還原成四氫葉酸(THF)。 HAT培養(yǎng)基中有外源的胸苷，通過胸苷激酶的作用， tk+能以其為底物合成出 TTP，則 tk+細(xì)胞可繼續(xù)存活；而 tk細(xì)胞無這種合成作用，則死亡。 ① 胸腺核苷激酶基因 ? 胸苷激酶 (TK)是核苷酸合成代謝途徑中的一種酶，能夠把胸苷轉(zhuǎn)換為胸苷 磷酸，保證核苷酸的順利合成。 ? 胸腺核苷激酶基因（ tk）、二氫葉酸還原酶基因（ dhfr）及次黃嘌呤 鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶基因（ hgprt）等的表達(dá)產(chǎn)物直接或間接參與核苷酸合成代謝。 ? 冠 癭 堿合成酶基因在植物細(xì)胞中的表達(dá)產(chǎn)物可以催化一些特殊反應(yīng)，通過電泳分離及菲醌熒光染料染色，方便地觀察，據(jù)此作為報告基因用于轉(zhuǎn)植物基因細(xì)胞的篩選。 ⑤ 螢火蟲熒光素酶基因（ luc） ? luc表達(dá)產(chǎn)物螢火蟲熒光素酶（ LUC）在 Mg2+的作用下， 可以與熒光素和 ATP底物發(fā)生反應(yīng)， 形成 與酶結(jié)合的 腺苷酸熒光素?；瘡?fù)合物， 經(jīng)過氧化脫羧作用后， 該復(fù)合物轉(zhuǎn)變成為處于激活狀態(tài)的氧化熒光素，可以用熒光測定儀快速靈敏地檢測出產(chǎn)生的熒光，是目前研究動植物轉(zhuǎn)基因很好用的一種報告基因。 ? ③氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因（ cat）也被用于篩選動植物轉(zhuǎn)化子的標(biāo)記基因。常用的報告基因有抗生素抗性基因以及編碼某些酶類或其他持殊產(chǎn)物的基因等。 ? 此方法主要用于原核生物。如果在載體 DNA上組入 β 半乳糖苷酶基因（ lacZ)部分缺失的片段 (lacZ’)．則重組 DNA分子轉(zhuǎn)化 lacZ’互補型菌落，會在含有 Xgal和IPTG的培養(yǎng)基中得到的轉(zhuǎn)化子是藍(lán)色菌落。 ? 例如 pTR262質(zhì)粒載體，它由 pBR322衍生而來，其 Tcr基因的上游含有一段 λ 噬菌體 DNA的 CI阻遏蛋白編碼基因及其調(diào)控序列， CI基因表達(dá)的阻遏蛋白可以抑制 Tcr基因的表達(dá)。 ? 選擇培養(yǎng)基 是根據(jù)宿主細(xì)胞類型配置的培養(yǎng)基，對于細(xì)菌受體細(xì)胞而言，通常用 LB培養(yǎng)基，在 LB培養(yǎng)基中加入適量的某種選擇物．即為選擇培養(yǎng)基。 ? 經(jīng)過各種方法將外源 DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞后，獲得所需陽性克隆子的過程稱為 克隆子的篩選。 ? 把采用各種轉(zhuǎn)化方法或轉(zhuǎn)導(dǎo)方法獲得的克隆子叫做 轉(zhuǎn)化子（ 導(dǎo)入外源 DNA分子后能穩(wěn)定存在的受體細(xì)胞稱為 轉(zhuǎn)化子 ） ，現(xiàn)在這兩者有通用的趨向。這很可能是由于預(yù)處理導(dǎo)致中期停頓的細(xì)胞中，細(xì)胞核處于無膜狀態(tài)，或者核膜具有較高的通透性所致。 ? 用此方法轉(zhuǎn)基因的效率很高。 ? 目前有關(guān) DEAE葡聚糖的作用機制一般認(rèn)為 DEAE葡聚糖能與外源 DNA形成復(fù)合物，保護(hù) DNA免受核酸酶的降解；其次是 DEAE葡聚糖可作用于受體細(xì)胞膜，增加其通透性，便于 DNA進(jìn)入。 ? 三，雖然帶目的基因的 SV40病毒是早期轉(zhuǎn)錄缺陷型的，但被感染的 COS細(xì)胞系的基因組中整合有 SV40早期轉(zhuǎn)錄區(qū)段 DNA，所以沒有必要用輔助病毒作混合感染。 ⑧ 花粉管通道法 ? 將外源 DNA涂于授粉的枝頭上，使 DNA沿花粉管通道或傳遞組織通過珠心進(jìn)入胚囊，轉(zhuǎn)化還不具正常細(xì)胞壁的卵、合子及早期的胚胎細(xì)胞。 ? 利用超聲波處理可以避免脈沖高電壓對細(xì)胞的損傷作用，有利于原生質(zhì)體存話，是一種有潛力的轉(zhuǎn)化途徑。 ? 這一技術(shù)的關(guān)鍵是原生質(zhì)體或具壁細(xì)胞或細(xì)胞團的固定。 ? 這種利用激光微束照射受體細(xì)胞實現(xiàn)外源 DNA直接導(dǎo)入、整合和表達(dá)的技術(shù)稱之為 激光微束穿孔轉(zhuǎn)化法 。 ? 本法中 線性 DNA比環(huán)形 DNA有更高的轉(zhuǎn)化效率，而單鏈 DNA又比雙鏈 DNA更為有效 。這些多聚物和二價陽離子 (如 Mg2+、 Ca2+、 Mn2+)與DNA混合，能在原生質(zhì)體表面形成沉淀顆粒，通過原生質(zhì)體的內(nèi)否噬作用而被吸收進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。此方法類似于原生質(zhì)體共培養(yǎng)轉(zhuǎn)化法，主要差別是首先建立懸浮細(xì)胞系。 ? ② 整體植株接種轉(zhuǎn)化法： 人為地在整體植株上造成創(chuàng)傷部位，然后把農(nóng)桿菌接種在創(chuàng)傷表面，或用針頭把農(nóng)桿菌注射到植株體內(nèi)、使農(nóng)桿菌按照天然的感染過程在植株體內(nèi)進(jìn)行侵染，獲得轉(zhuǎn)化的植物愈傷組織或轉(zhuǎn)基因植株。 ? 脫菌培養(yǎng) 是指把共培養(yǎng)后的外植體轉(zhuǎn)移到含有抗生素的培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)生長的過程。通常采用較低的菌液 OD值和較短的浸泡時間來進(jìn)行外植體的接種。 ③轉(zhuǎn)化外植體易于組織培養(yǎng)，并有較強的再生能力。 選擇適宜的外植體是成功進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化的首要條件 ，而外植體的選擇主要是依據(jù)受體細(xì)胞的轉(zhuǎn)化能力來決定的。 重組 DNA分子轉(zhuǎn)入真核細(xì)胞 ? DNA分子導(dǎo)入植物細(xì)胞 ? （ 1）農(nóng)桿菌介導(dǎo)的 Ti質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化法 ? 農(nóng)桿菌是一類土壤習(xí)居菌，革蘭氏染色呈陰性，能感染雙子葉植物和裸子植物，對絕大多數(shù)單子葉植物無侵染能力。 ? 如在大腸桿菌系統(tǒng)中，重組質(zhì)粒載體上多含有 AMP抗性標(biāo)記基因，則所選用的受體細(xì)胞應(yīng)對這種抗生素敏感。 ? 因此 受體細(xì)胞必須選擇體內(nèi)同源重組缺陷型的遺傳表型 ，基因型為 recA、 recB或 recC等，有些大腸桿菌突變體菌株則將三個基因同時失活。 ? 進(jìn)一步 使修飾系統(tǒng)也發(fā)生缺陷 ，則受體菌細(xì)胞既不能修飾，也不能限制外源 DNA分子，更便于重組 DNA分子的多種基因操作。 受體細(xì)胞的選擇 ? 野生型的大腸桿菌不是理想的受體細(xì)胞， 因為自身具有的限制和修飾系統(tǒng)，另外還可能存在潛在的致病性。上清液中含活的噬菌體顆粒。 ? 第二次包裝 。 ? ②體外包裝 。 ? 基本原理，根據(jù) λ 噬菌體 DNA體內(nèi)包裝的途徑，分別獲得缺失 D包裝蛋白的 λ 噬菌體突變株和缺失 E包裝蛋白的 λ 噬菌體突變株。 ? 轉(zhuǎn)導(dǎo) (transduction)是指通過 λ 噬菌體 (病毒 )顆粒感染宿主細(xì)胞的途徑把外源 DNA分子轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞內(nèi)的過程。 ? 如 Ca2+誘導(dǎo)大腸桿菌轉(zhuǎn)化法，菌齡、 Cacl2處理時間、感受態(tài)細(xì)胞的保存期以及熱激時間均是重要的影響因素。在 10ng／ 1