【正文】 ? 4 什么是 mRNA減法雜交 法？基本操作過程有哪些？ ? 5 簡述基因文庫的構(gòu)建技術(shù)路線。經(jīng) Xgal藍(lán)白斑初步篩選出具有插入的克隆 ， 再經(jīng)探針雜交找出具有差別表達(dá)的cDNA片段。因此 ， 最終的結(jié)果 是驅(qū)趕 cDNA與檢測 cDNA中的相同部分得到抑制 ， 而在驅(qū)趕 cDNA中缺乏但卻存在于檢測 cDNA的序列 ， 即差異表達(dá) cDNA序列得到顯著的擴(kuò)增。 2022/2/12 第二節(jié) 目的基因的分離 114 ? ④第二次差減雜交 ： 合并第一次雜交后的兩份雜交產(chǎn)物 ， 再與過量的驅(qū)趕 cDNA進(jìn)行變性、復(fù)性雜交 ， 此時(shí) ， 只有第一次雜交后經(jīng)豐度均等化和消減的單鏈檢測 cDNA和驅(qū)趕 cDNA一起形成各種雙鏈分子 ， 這次雜交進(jìn)一步富集了差異表達(dá)基因的cDNA， 并產(chǎn)生了一種新的雙鏈分子 (e)， 它的兩個(gè) 539。此外 ， 接頭上含有T7啟動子序列及內(nèi)切酶識別位點(diǎn) ， 為以后將該片段插入克隆載體和測序提供便利 。用限制性核酸內(nèi)切酶切割 ， 產(chǎn)生大小適當(dāng)?shù)钠筋^末端 cDNA片段。 2022/2/12 第二節(jié) 目的基因的分離 110 cDNA RDA 基本流程圖 2022/2/12 第二節(jié) 目的基因的分離 111 抑制性減法雜交技術(shù) （ suppression subtractive hybridization,SSH) ? SSH 的主要原理 ? SSH 的核心技術(shù)是抑制性 ， 它是一種將檢測子 cDNA單鏈標(biāo)準(zhǔn)化步驟和消減雜交步驟結(jié)合為一體的技術(shù)。 2022/2/12 第二節(jié) 目的基因的分離 108 ③特異片段的富集 ? 在上述四種組合的 DNA片段中 ， 經(jīng) S1核酸酶處理除去單鏈 DNA， 這時(shí)只有檢測 DNA兩端帶有 接頭 J24J12。 2022/2/12 第二節(jié) 目的基因的分離 107 ② 液相雜交 ? 檢測 DNA和驅(qū)趕 DNA按一定的比例 (1:100～ 200)， 在適當(dāng)?shù)木彌_體系中高溫變性 ， 中溫 (67℃ )長時(shí)間復(fù)性 (20h)后 ， 90%的單鏈 DNA都復(fù)性成穩(wěn)定的雙鏈結(jié)構(gòu) ， 出現(xiàn)四種情況的組合 DNA片段 ； ? 檢測 DNA中僅有的片段自身復(fù)性 。 2022/2/12 第二節(jié) 目的基因的分離 105 代表性差別分析技術(shù) 流程 ? 代表性差別分析是通過突變型 (驅(qū)趕 DNA,driver DNA,DDNA)與野生型 (檢測 DNA,tester DNA,TDNA)基因組之間的差異比較來分離和鑒定突變基因的方法。 2022/2/12 102 隨機(jī) 錨定引物 PCR的產(chǎn)物電泳比較 不同組織的 240組引物組合 PCR產(chǎn)物在測序膠中電泳。RTNM TTT TTT TT 5 ’3 ’N N N N N N N N N N5 ’ 3 ’N N N N N N N N N N5 ’3 ’cDNA 第二鏈，并 PCR第一鏈。這樣 ， 每一種此類人工合成的寡核 苷 酸引物 ， 都將能夠把總 mRNA群體的 1/12分子反轉(zhuǎn)錄成mRNAcDNA雜交分子。 2022/2/12 第二節(jié) 目的基因的分離 99 mRNA 差別顯示技術(shù)的原理和基本程序 ? 以 mRNA為模板 ， 以 oligo(dT)為引物合成出 cDNA。 2022/2/12 第二節(jié) 目的基因的分離 97 ? C 將雜交反應(yīng)混合物通過生物素結(jié)合蛋白質(zhì)柱 ， 大部分野生型的 DNA分子因與突變型的生物素標(biāo)記的驅(qū)使 DNA探針雜交而結(jié)合到柱上 ， 而野生型中特定的 DNA片段 B, 由于在突變型 DNA中缺失了相應(yīng)的片段 ， 故沒有相應(yīng)的標(biāo)記的探針與之雜交 ， 經(jīng)洗脫流出。此法的不足之處是只適于具有較大缺失突變體的基因分離 。前者用于克隆兩樣品中特異性存在的基因 ， 后者用于分析兩樣品中差異表達(dá)的基因 ， 尤其 適于某些低豐度 mRNA的 cDNA克隆。 ? 重復(fù)性差。 2022/2/12 第二節(jié) 目的基因的分離 91 利用 差 別雜交 法 篩選 生長因 子調(diào)節(jié) 基因 圖 2022/2/12 第二節(jié) 目的基因的分離 92 局限性 ? 靈敏度比較低 ， 不適 用 某些低豐度 mRNA的目的基因的分離。 2022/2/12 第二節(jié) 目的基因的分離 90 ? 差別雜交法 ： 又 稱為差別篩選 (differential screening)法 ，分別制備兩種不同細(xì)胞群體的 mRNA提取物 ， 其中一種含有目的基因 mRNA， 另一種不含有目的基因 mRNA。 ? 可以通過基因文庫的篩選或基因定位的方法分離目的基因?，F(xiàn)該法已成為快速分離克隆新基因的一種有效手段。雜交后洗去膜上非結(jié)合的探針 ， 經(jīng)放射自顯影確定。 ? 可先從 DNA序列數(shù)據(jù)庫中查找有關(guān)基因的序列 ， 再用該基因序列或其一部分作為探針篩選該基因的克隆 ； ? 在自然界的長期進(jìn)化過程中 ， 一些蛋白質(zhì)的基因編碼序列保持著高度的保守性 ， 因此在生物的種、屬之間 ， 基因編碼序列有著很高的同源性 。這也是通常所說的目的基因的功能克隆策略。 ? ⑦套式 PCR: 用引物對 (l)和 (2)或 (3)分別作外側(cè)引物和內(nèi)部引物可以擴(kuò) 增不同長度的 DNA片段，其中包括完整的已知序列。兩側(cè)都帶有完整的已知基因序列。 ? ②合成一個(gè)與 5‘末端堿基和已知基因的 5’端內(nèi)部某個(gè)區(qū)域能互補(bǔ)的附加引物 ， 與上述線性化片段的 3’端連接 ， 539。鍋柄 PCR就是為擴(kuò)增未知序列而設(shè)計(jì)的一種策略 。 2022/2/12 第一節(jié) 目的基因的制備 73 第二 長距離 RTPCR( 兩階段雙管式 ) ? 長距離 RTPCR與連續(xù) RTPCR都是使兩種酶促反應(yīng)分開進(jìn)行 ， 但長距離 RTPCR能擴(kuò)增全長 cDNA， 得到更長的 DNA 產(chǎn)物。通過 mRNA反轉(zhuǎn)錄 ， 得到對應(yīng)的 cDNA， 然后利用特定的 PCR引物直接以反轉(zhuǎn)錄得到的 cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng) ， 獲得大量所需的基因。 ? 為保證擴(kuò)增特異性 ， 錨定引物通常在 12堿基以上。 第三 ， 用另一種限制酶消化 ，將環(huán)狀 DNA從已知區(qū)域中間切開 ， 則線性化 DNA的兩側(cè)為已知序列 ， 未知區(qū)域夾在中間 ，用與已知區(qū)域可使未知序列大量擴(kuò)增出來。 ? 套式 PCR較常規(guī) PCR靈敏度大大提高 ， 同時(shí)也有較強(qiáng)的的特異性 ， 假 陽 性極少。 ? 如要大量擴(kuò)增未知序列的特異 DNA片段 ， 或是更長的 DNA片段 ， 則須選擇特殊類型的 PCR策略。 ? 模板 ： 基因組 DNA， mRNA序列 ， 或是已克隆到某一載體上的基因片段。 ? ⑤ cDNA的分部收集 (非必需步驟 )。 ? ①轉(zhuǎn)錄酶以 oligo(dT)為引物合成 cDNA第一鏈。 cDNA第一鏈 5’ cDNA第二鏈合成 DNA聚合酶 cDNA第一鏈 cDNA第二鏈 5’ 3’ ③ cDNA第二鏈合成 2022/2/12 58 ④ 去掉發(fā)卡結(jié)構(gòu) 核酸酶 S1 用 核酸酶 S1可以切掉發(fā)卡結(jié)構(gòu)（但這會導(dǎo)致 cDNA中有用的序列被切掉?。? 用 Oligo dT（或隨機(jī)引物）作引物，合成cDNA的第一鏈。 2022/2/12 53 分離 mRNA用商業(yè)化的 Oligo dT纖維柱。 （ 2）可以在細(xì)菌中直接表達(dá)。相反地，當(dāng)特異性的 DNA片段是通過 PCR或直接化學(xué)合成的方式獲得的時(shí)候，也就不需要后續(xù)的篩選了。 DNA同胞選擇法是按矩陣分值亞庫，用 mRNA與 cDNA雜交后釋放出 mRNA ，使其在無細(xì)胞蛋白合成體系中翻譯，并對翻譯產(chǎn)物進(jìn)行免疫沉淀、 PAGE電影鑒定或活性分析等來篩選目的快樂，該方法要求全長 cDNA，一般只在無其他方法可用或表達(dá)產(chǎn)物很小時(shí)才用 2022/2/12 45 （ 4） PCR篩選法 ? 其顯著特點(diǎn)是快速、簡便。主要方法有： ?核酸雜交方法； ?免疫學(xué)檢測方法； ?DNA同胞選擇法（極少用）； ?PCR篩選法； ?其他方法。若將雜交陽性結(jié)果記為“ 1” ，而陰性結(jié)果記為“ 0” ，可清晰地列成一張表，最終排出上述 YAC克隆的排列順序 。這項(xiàng)工作的工作量可能遠(yuǎn)大于基因組文庫的構(gòu)建，屬于基因文庫的后期制作 2022/2/12 第一節(jié) 目的基因的制備 35 （ 1）酶切片段末端標(biāo)記法 ? 將單一的 YAC克隆插入 DNA片段用限制性內(nèi)切酶分布均勻地水解成若干片段，末端標(biāo)記同位素。 ?平末端連接反應(yīng)的效率相對較低 ， 它需要較高濃度的平末端 、 較大的連接酶量 、 較低濃度的 ATP以及不能有象亞精胺一類的多胺 。 ?連接前，上述處理的 DNA片段必須根據(jù)載體的裝載量進(jìn)行分級分離，以杜絕不相干的 DNA片段隨機(jī)連為一體。 上述幾種載體的最大裝載量如下： ? lDNA ? 質(zhì)粒 ? 考斯質(zhì)粒 ? 10 kb ? 23 kb ? 45 kb ? BAC ? 300 kb 用于基因文庫構(gòu)建的受體則根據(jù)載體使用大腸桿菌或酵母菌 2022/2/12 第一節(jié) 目的基因的制備 25 載體與基因組 DNA的切割 ?用于基因組文庫構(gòu)建的 DNA片段的切割 一般采用超聲波處理和限制性內(nèi)切酶部分酶切兩種方法 ，其目的是： ?第一 保證 DNA片段之間存在部分重疊區(qū)。 2022/2/12 第一節(jié) 目的基因的制備 23 基因組 DNA的制備 ? A ? A ? A ? A ?文庫構(gòu)建的 DNA在分離純化操作中應(yīng)盡量避免過度的斷裂。 2022/2/12 第一節(jié) 目的基因的制備 17 從基因組文庫中釣取目的基因 ? ? ? 基因庫 (gene pool):特定生物體全基因組的集合（天然存在） ? 基因文庫 (gene library or gene bank):從特定生物個(gè)體中分離的全部 基因，這些基因以 克隆 的形式存在（人工構(gòu)建） 一個(gè)受體菌的群體之中 , 這個(gè)群體即為這種生物的基因文庫。前者操作繁瑣，基本上已淘汰；后者反應(yīng)中間物的分離程序簡便， DNA合成儀就是根據(jù) 固相亞磷酸三酯法 原理設(shè)計(jì)的 2022/2/12 13 OHGHH HHOCH2OD M TPOMeNCHMeMeCHMeMeO H G H H H H O CH 2 O DMT P O Me N CH Me Me CH Me Me H 激活 縮合 氧化 脫取代基 ? 玻璃珠 化學(xué)合成的單元操作 ?DMT： 二甲氧基三苯甲基 連接臂 2022/2/12 14 合成天然基因 修飾改造基因 設(shè)計(jì)新型基因 制備探針、引物、接頭 DNA化學(xué)合成的用途 如生長激素釋放抑制素基因、腦啡肽基因、胰島素基因、干擾素基因等 如組織型纖溶酶原激活劑基因、尿激酶原基因等 2022/2/12 第一節(jié) 目的基因的制備 15 第一節(jié) 目的基因的制備 ? 1 直接法制備基因 ? 2 從基因組文庫中釣取目的基因 ? 3 從 cDNA文庫中釣取目的基因 ? 4 利用 PCR直接擴(kuò)增出目的基因 2022/2