【文章內(nèi)容簡介】 CGA TAT CAG ATC TCC CGG GGC GGC CGC Xa1 Ile Glu Gly Arg Glu ATC GAA GGT CGC GAA AGC TTC AGC TGG GAT CCG GTA CCG ATA TCA GAT CTC CCG GGG CGG CCG C Xa2 ATC GAA GGT CGC GAA AAG CTT CAG CTG GGA TCC GGT ACC GAT ATC AGA TCT CCC GGG GCG GCC GC Xa3 NruI HindIII PvuII BamHI KpnI EcoRV BglII SmaI NotI Xa因子切割位點(diǎn) 20221022 53 目的基因在宿主中的表達(dá) 寡聚型異源蛋白的表達(dá) 構(gòu)建串聯(lián)型異源蛋白表達(dá)載體，將多拷貝的外源基因克隆在一個(gè)低拷 貝質(zhì)粒上，以取代單拷貝外源基因在高拷貝載體上表達(dá)的策略。 20221022 54 目的基因在宿主中的表達(dá) 整合型異源蛋白的表達(dá) 整合型的目的基因隨受體細(xì)胞染色體 DNA的復(fù)制而復(fù)制，在大 多數(shù)情況下相當(dāng)穩(wěn)定，工程菌在沒有選擇壓力存在下可以連續(xù) 培養(yǎng)而不丟失目的基因表達(dá)盒，這對以改良物種遺傳性狀為目 的的基因工程案例特別有意義。 20221022 55 目的基因在宿主中的表達(dá) 蛋白酶抗性或缺陷型表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建 無論是在真核生物還是在原核細(xì)胞中，重組目的蛋白表達(dá)后都 會面臨被降解的命運(yùn)，其穩(wěn)定性甚至還不如半衰期較短的受體細(xì)胞 內(nèi)源性蛋白質(zhì)。 在大多數(shù)情況下，重組目的蛋白的不穩(wěn)定性可歸結(jié)為對受體細(xì) 胞蛋白酶系統(tǒng)的敏感性。然而越來越多的實(shí)驗(yàn)表明，重組目的蛋白 在受體細(xì)胞內(nèi)的半衰期可以通過蛋白序列的人工設(shè)計(jì)以及受體細(xì)胞 的改造加以調(diào)整和控制。 20221022 56 目的基因在宿主中的表達(dá) ?基因工程菌遺傳不穩(wěn)定性的表現(xiàn)與機(jī)制 ?改善基因工程菌不穩(wěn)定性的策略 20221022 57 目的基因在宿主中的表達(dá) 基因工程菌遺傳不穩(wěn)定性的表現(xiàn)與機(jī)制 （ 1）工程菌遺傳不穩(wěn)定性的表現(xiàn)形式 基因工程菌的遺傳不穩(wěn)定性主要表現(xiàn)在重組質(zhì)粒的不穩(wěn)定性，這種不穩(wěn)定性具有下列兩種表現(xiàn)形式： ?結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定性： 重組 DNA分子上某一區(qū)域發(fā)生缺失、重排、修飾，導(dǎo)致其表觀生物學(xué)功能的喪失。 ?分配不穩(wěn)定性： 整個(gè)重組 DNA分子從受體細(xì)胞中逃逸（ curing） 20221022 58 目的基因在宿主中的表達(dá) （ 2）工程菌遺傳不穩(wěn)定性的產(chǎn)生機(jī)制 ?受體細(xì)胞中的限制修飾系統(tǒng)對外源重組 DNA分子的降解； ?外源基因的高效表達(dá)嚴(yán)重干擾受體細(xì)胞正常的生長代謝； ?能量、物質(zhì)的匱乏和外源基因表達(dá)產(chǎn)物的毒性誘導(dǎo)受體細(xì)胞產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)：關(guān)閉合成途徑，啟動降解程序； ?重組質(zhì)粒在受體細(xì)胞分裂時(shí)的不均勻分配，這是重組質(zhì)粒逃逸的基本原因； ?受體細(xì)胞中內(nèi)源性的轉(zhuǎn)座元件促進(jìn)重組分子的缺失重排。 20221022 59 目的基因在宿主中的表達(dá) （ 3）重組質(zhì)粒的逃逸率 當(dāng)含有重組質(zhì)粒的工程菌在非選擇性條件下生長時(shí)，培養(yǎng)系統(tǒng)中 一部分細(xì)胞不再攜帶重組質(zhì)粒，這些空載細(xì)胞數(shù)與總細(xì)胞數(shù)之比稱為 稱為 重組質(zhì)粒的宏觀逃逸率 。重組質(zhì)粒逃逸的原因有： ?高溫培養(yǎng)、表面活性劑（ SDS）、藥物（利福平）、染料（吖啶）促使重組質(zhì)粒滲漏； ?受體細(xì)胞中的核酸酶降解重組質(zhì)粒； ?重組質(zhì)粒在受體細(xì)胞分裂時(shí)不均勻分配，細(xì)胞所含重組質(zhì)?？截悢?shù)的差異隨著細(xì)胞分裂次數(shù)的增多而加劇。 20221022 60 目的基因在宿主中的表達(dá) 改善基因工程菌不穩(wěn)定性的策略 （ 1）改進(jìn)載體受體系統(tǒng) 以增大質(zhì)粒穩(wěn)定性為目的的構(gòu)建方法包括： ?將 R1質(zhì)粒上的 parB基因引入表達(dá)型載體中， 其表達(dá)產(chǎn)物可以選擇性地殺死由于分配不均勻所產(chǎn)生的無質(zhì)粒細(xì)胞； ?正確設(shè)置載體上的多克隆位點(diǎn)，禁止 DNA片段插在非穩(wěn)定區(qū)內(nèi)； 20221022 61 目的基因在宿主中的表達(dá) （ 2）施加選擇壓力 ?根據(jù)載體上的抗藥性標(biāo)記，向培養(yǎng)系統(tǒng)中添加相應(yīng)的抗生素。但注意，藥物和食品生產(chǎn)時(shí)禁止使用抗生素。 ?根據(jù)載體上的營養(yǎng)缺陷型標(biāo)記，向培養(yǎng)系統(tǒng)中添加相應(yīng)的營養(yǎng)組份。 培養(yǎng)基復(fù)雜，成本較高。 20221022 62 目的基因在宿主中的表達(dá) （ 3）控制目的基因的過量表達(dá) 20221022 63 目的基因在宿主中的表達(dá) （ 4）優(yōu)化基因工程菌的培養(yǎng)工藝 ?使用可控型啟動子控制目的基因的定時(shí)表達(dá)及表達(dá)程度； ?使用可控型復(fù)制子控制質(zhì)粒的定時(shí)增殖或降低質(zhì)粒的拷貝數(shù)。 ?培養(yǎng)基組成：限制培養(yǎng)基比豐富培養(yǎng)基更有利于穩(wěn)定； ?培養(yǎng)溫度：較低的培養(yǎng)溫度有利于重組質(zhì)粒的穩(wěn)定。 20221022 目的基因在宿主中的表達(dá) 64 1982年，美國 Ely LiLi公司首先使用重組大腸桿菌生產(chǎn)人胰島素，成為世界上第一個(gè)上市的基因工程藥物。 1987年， Novo公司推出了利用重組酵母菌生產(chǎn)人胰島素的新工藝。上述由基因工程菌合成的重組人胰島素在體外胰島素受體結(jié)合性能 、 淋巴細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的應(yīng)答能力 、 降血糖作用 、 血漿藥代動力學(xué) 等指標(biāo)上均與天然胰島素沒有任何區(qū)別，而且還具有 無免疫原性 、 注射吸收迅速等 優(yōu)點(diǎn)，充分展示了基因工程在生物醫(yī)藥領(lǐng)域中的巨大潛力。 20221022 65 目的基因在宿主中的表達(dá) B鏈分別表達(dá)法 基因工程菌的構(gòu)建策略： 20221022 66 目的基因在宿主中的表達(dá) 表達(dá)產(chǎn)物的后處理路線： 20221022 67 目的基因在宿主中的表達(dá) 生產(chǎn)技術(shù)的評價(jià)： 由于 A鏈和 B鏈上共存在六個(gè)半胱氨酸殘基，體外二硫鍵的正確配對率較低，通常只有 10% 20%，因此采用這條工藝路線生產(chǎn)的重組人胰島素每克成本高達(dá) 100美元 以上。為了進(jìn)一步降低生產(chǎn)成本，美國 Ely LiLi公司隨后又建立了第二條生產(chǎn)重組人胰島素的工藝路線。 20221022 68 目的基因在宿主中的表達(dá) 基因工程菌的構(gòu)建策略： 20221022 69 目的基因在宿主中的表達(dá) 表達(dá)產(chǎn)物的后處理路線： 20221022 70 目的基因在宿主中的表達(dá) 生產(chǎn)技術(shù)的評價(jià)： 在人胰島素原表達(dá)工藝中，由于 C肽的存在，胰島素原能形成良好的空間構(gòu)象，三對二硫鍵的正確配對率也相應(yīng)提高，折疊率高達(dá) 80%以上。雖然這條工藝路線并不比 AB鏈分別表達(dá)法更為簡捷，而且還要使用兩種高純度的酶制劑，但理想的折疊率在很大程度上彌補(bǔ)了工藝繁瑣的缺陷，使得每克最終產(chǎn)品的成本僅 50美元 。目前美國 Ely LiLi公司采用此工藝年產(chǎn) 十幾噸 的重組人胰島素。 20221022 71 目的基因在宿主中的表達(dá) A鏈和 B鏈同時(shí)表達(dá)法 20221022 72 目的基因在宿主中的表達(dá) 上述三種重組大腸桿菌的構(gòu)建路線均采用胰島素或胰島素原編碼序列與大腸桿菌 b半乳糖苷酶 基因拼接的方法，所產(chǎn)生的融合型重組蛋白表達(dá)率高、穩(wěn)定性強(qiáng)，但不能分泌，只要以包涵體的形式存在于胞質(zhì)中。一種能促進(jìn)融合蛋白分泌的工程菌構(gòu)建策略是將胰島素或胰島素原編碼序列與 b內(nèi)酰胺酶 基因拼接， b內(nèi)酰胺酶通常能被大腸桿菌分泌到胞外。由此獲得的工程菌同時(shí)具備了穩(wěn)定高效表達(dá)可分泌型融合蛋白的優(yōu)良特性，為胰島素的后續(xù)分離純化工序減輕了負(fù)擔(dān)。 20221022 73 目的基因在宿主中的表達(dá) 二、外源基因在酵母菌中的表達(dá) 20221022 74 目的基因在宿主中的表達(dá) 酵母菌（ Yeast）是一群以芽殖或裂殖方式進(jìn)行無性繁殖的單細(xì) 胞真核生物，分屬于子囊菌綱（子囊酵母菌）、擔(dān)子菌綱（擔(dān)子酵母 菌）、半知菌類（半知酵母菌），共由 56個(gè)屬和 500多個(gè)種組成。 如果說大腸桿菌是外源基因最成熟的原核生物表達(dá)系統(tǒng)，則酵母 菌是最成熟的真核生物表達(dá)系統(tǒng)。 20221022 75 目的基因在宿主中的表達(dá) ?全基因組測序，基因表達(dá)調(diào)控機(jī)理比較清楚，遺傳操作簡便； ?具有原核細(xì)菌無法比擬的真核蛋白翻譯后加工系統(tǒng)； ?大規(guī)模發(fā)酵歷史悠久、技術(shù)成熟、工藝簡單、成本低廉； ?能將外源基因表達(dá)產(chǎn)物分泌至培養(yǎng)基中； ?不含有特異性的病毒、不產(chǎn)內(nèi)毒素，美國 FDA認(rèn)定為安全的基因工程受體系統(tǒng)（ Generally Recognized As Safe， GRAS）； ?酵母菌是最簡單的真核模式生物 20221022 76 目的基因在宿主中的表達(dá) ?廣泛用于外源基因表達(dá)的酵母宿主菌 ?提高重組蛋白表達(dá)產(chǎn)率的突變宿主菌 ?抑制超糖基化作用的突變宿主菌 ?減少泛素依賴型蛋白降解作用的突變宿主菌 20221022 77 目的基因在宿主中的表達(dá) 目前已廣泛用于外源基因表達(dá)和研究的酵母菌包括： 酵母屬： 如釀酒酵母（ Saccharomyces cerevisiae） 克魯維酵母屬： 如乳酸克魯維酵母（ Kluyveromyces lactis） 畢赤酵母屬： 如巴斯德畢赤酵母（ Pichia pastoris） 裂殖酵母屬： 如非洲酒裂殖酵母（ Schizosaccharomyces pombe） 漢遜酵母屬： 如多型漢遜酵母（ Hansenula polymorpha） 其中 釀酒酵母 的遺傳學(xué)和分子生物學(xué)研究最為詳盡，但 巴斯德畢赤酵母 表達(dá)外源基因最理想。 廣泛用于外源基因表達(dá)的酵母宿主菌 20221022 78 目的基因在宿主中的表達(dá) 能提高釀酒酵母中重組蛋白產(chǎn)量或改善其質(zhì)量的突變類型 突變類型 ssc1 ssc2 rgr1 ose1 ssc11 rho 生物效應(yīng) 改善重組蛋白分泌 提高重組蛋白表達(dá) 提高重組蛋白表達(dá) 提高重組蛋白表達(dá) 改善重組蛋白分泌 提高重組蛋白表達(dá) 作用位點(diǎn) 鈣離子依賴型的 ATP酶 轉(zhuǎn)錄后加工 轉(zhuǎn)錄水平 轉(zhuǎn)錄水平 羧肽酶 Y 轉(zhuǎn)錄水平 20221022 79 目的基因在宿主中的表達(dá) 提高重組蛋白表達(dá)產(chǎn)率的突變宿主菌 mnn alg och 抑制超糖基化作用的突變宿主菌 酵母菌普遍擁有蛋白質(zhì)的糖 基化系統(tǒng)，但野生型釀酒酵 母對異源蛋白的糖基化反應(yīng) 很難控制，呈超糖基化傾向， 因此超糖基化缺陷株非常重 要。 能抑制超糖基化的突變類型 突變類型 生物效應(yīng) 甘露糖生物合成缺陷型 天門冬酰胺側(cè)鏈糖基化缺陷型 外側(cè)糖鏈添加缺陷型 20221022 80 目的基因在宿主中的表達(dá) 許多真核生物的蛋白質(zhì)在其天門冬酰胺側(cè)鏈上接有寡糖基團(tuán)，它們常常影響蛋白質(zhì)的生物活性。 減少泛素依賴型蛋白降解作用的突變宿主菌 泛素降解途徑衰減的釀酒酵母 UBI 4缺陷型： 在釀酒酵母菌中，泛素主要由 UBI 4基因表達(dá)， UBI 4缺陷突變株能正常生長，但細(xì)胞內(nèi)游離泛素分子的濃度比野生株要低得多，因此UBI 4缺陷突變株是外源基因表達(dá)理想的受體。 UBA1缺陷型： UBA1編碼泛素激活酶 E1， UBA1突變株是致死性的，但其等位基因缺陷是非致死性的，而且也能削弱泛素介導(dǎo)的蛋白降解。 Ubc4 ubc5 雙突變型： 七個(gè)泛素連接酶基因的突變對衰減蛋白降解作用同樣有效。 20221022 81 目的基因在宿主中的表達(dá) ?酵母菌中的野生型質(zhì)粒 ?酵母菌克隆表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 20221022 82 目的基因在宿主中的表達(dá) 酵母菌中的野生型質(zhì)粒 （ 1）釀酒酵母中的 2181。環(huán)狀質(zhì)粒 幾乎所有的釀酒酵母中都含有 2181。雙鏈 環(huán)狀質(zhì)粒，拷貝數(shù)達(dá) 50至 100個(gè)。 IRs 反向重復(fù)序列， 600 bp，重組 FLP 編碼產(chǎn)物驅(qū)動 IRs的同源重組 REP 編碼產(chǎn)物控制質(zhì)粒的穩(wěn)定性 STB REP的結(jié)合位點(diǎn) 接合酵母屬中的 pSR1和 pSB1，以及 克魯維酵母屬中的 pKD1等，均與 2181。質(zhì) 粒類似。 20221022 83 目的基因在宿主中的表達(dá) （ 2）乳酸克魯維酵母中的線狀質(zhì)粒 乳酸克魯維酵母中含有兩種不同 的雙鏈線狀質(zhì)粒 pGKL1和 pGKL2。 拷貝數(shù)為 50100個(gè)，分別攜帶 K1 K2兩種能使多種酵母菌致死的毒 素蛋白編碼基因（ αβγ），同時(shí)含有毒素蛋白抗性基因。