外源基因在畢赤酵母中表達(dá)水平的預(yù)測(cè)(編輯修改稿)
2025-05-26 12:37 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 身的電荷差異的作用。 ? SDS能斷裂分子內(nèi)和分子間氫鍵，破壞蛋白質(zhì)的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)，強(qiáng)還原劑能使半胱氨酸之間的二硫鍵斷裂，使蛋白復(fù)合物分解成多個(gè)亞基。 ? 因此在電泳時(shí)，蛋白質(zhì)分子的遷移速度則主要取決于蛋白質(zhì)（亞基）分子大小。 ? 使聚丙烯酰胺凝膠具有分子篩效應(yīng)。 SDS的作用 本文由探生科技技術(shù)人員提供 ,Fantibody全球抗體搜索引擎，您身邊的抗體專家 ! 當(dāng)分子量在 15KD到 200KD之間時(shí)，蛋白質(zhì)的遷移率和分子量的對(duì)數(shù)呈線性關(guān)系，符合下式： logMW=KbX 式中： MW為分子量， X為遷移率， k、 b均為常數(shù)，若將已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的遷移率對(duì)分子量對(duì)數(shù)作圖，可獲得一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，未知蛋白質(zhì)在相同條件下進(jìn)行電泳，根據(jù)它的電泳遷移率即可在標(biāo)準(zhǔn)曲線上求得分子量。 有許多蛋白質(zhì)是由亞基（如血紅蛋白）或兩條以上肽鏈（如胰凝乳蛋白酶）組成的，它們?cè)?SDS和巰基乙醇作用下，解離成亞基或單條肽鏈，因此這一類蛋白質(zhì)，測(cè)定時(shí)只是它們的亞基或單條肽鏈的分子量。 分子量 相對(duì)遷移率 本文由探生科技技術(shù)人員提供 ,Fantibody全球抗體搜索引擎，您身邊的抗體專家 ! 被分離物質(zhì)分子量與凝膠濃度的選擇 分子量范圍 適用的凝膠濃度 (%) 蛋 白 質(zhì) ?104 2030 14 104 1520 15 1041 105 1015 1 105 510 ?5 105 25 核 酸 (DNA/RNA) ?104 1520 104–105 510 1052 106 本文由探生科技技術(shù)人員提供 ,Fantibody全球抗體搜索引擎，您身邊的抗體專家 ! 按照緩沖液的 pH值和凝膠孔徑的差異及有無濃縮效應(yīng)分為連續(xù)系統(tǒng)和不連續(xù)系統(tǒng)兩大類： ? 連續(xù)系統(tǒng)電泳體系中緩沖液 pH值及凝膠濃度相同，帶電顆粒在電場(chǎng)作用下，主要靠電荷和分子篩效應(yīng)分離。 ? 不連續(xù)系統(tǒng)中由于緩沖液離子成分、 pH、凝膠濃度以及電位梯度的不連續(xù)性，帶電顆粒在電場(chǎng)中泳動(dòng)不僅有電荷效應(yīng)，分子篩效應(yīng)，還具有濃縮效應(yīng)，因而其分離條帶清晰度及分辨率均較前者佳。 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分類： 本文由探生科技技術(shù)人員提供 ,Fantibody全球抗體搜索引擎，您身邊的抗體專家 ! ? 不連續(xù)體系由電極緩沖液、濃縮膠及分離膠所組成。 ? 濃縮膠是由 AP催化聚合而成的大孔膠，凝膠緩沖液為 TrisHC1。 ? 分離膠是由 AP催化聚合而成的小孔膠，凝膠緩沖液為 TrisHC1。 ? 電極緩沖液是 Tris甘氨酸緩沖液。 ? 2種孔徑的凝膠、 2種緩沖體系、 3種 pH值使不連續(xù)體系形成了凝膠孔徑、 pH值、緩沖液離子成分的不連續(xù)性，這是樣品濃縮的主要因素。 不連續(xù)系統(tǒng)的特點(diǎn) 本文由探生科技技術(shù)人員提供 ,Fantibody全球抗體搜索引擎，您身邊的抗體專家 ! 濃縮膠的作用 ? 濃縮膠的作用是有堆積作用，凝膠濃度較小，孔徑較大，把較稀的樣品加在濃縮膠上，經(jīng)過大孔徑凝膠的遷移作用而被濃縮至一個(gè)狹窄的區(qū)帶。 ? 當(dāng)樣品液和濃縮膠選 Tris/HCL緩沖液，電級(jí)液選 Tris/甘氨酸。電泳開始后， HCL解離成氯離子，甘氨酸解離出少量的甘氨酸根離子。蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷，因此一起向正極移動(dòng)，其中氯離子最快，甘氨酸根離子最慢，蛋白居中。 ? 電泳開始時(shí)氯離子泳動(dòng)率最大，超過蛋白，因此在后面形成低電導(dǎo)區(qū)，而電場(chǎng)強(qiáng)度與低電導(dǎo)區(qū)成反比，因而產(chǎn)生較高的電場(chǎng)強(qiáng)度，使蛋白和甘氨酸根離子迅速移動(dòng)，形成以穩(wěn)定的界面，使蛋白聚集在移動(dòng)界面附近，濃縮成一中間層。 本文由探生科技技術(shù)人員提供 ,Fantibody全球抗體搜索引擎，您身邊的抗體專家 ! A. 為電泳前 2層凝膠排列順序， 2層膠中均有快離子，慢離子 B. 顯示電泳開始后，蛋白質(zhì)樣品夾在快、慢離子之間被濃縮成極窄的區(qū)帶。 C. 顯示蛋白質(zhì)樣品分離成數(shù)個(gè)區(qū)帶。 電泳中離子運(yùn)動(dòng)示意圖 本文由探生科技技術(shù)人員提供 ,Fantibody全球抗體搜索引擎，您身邊的抗體專家 ! ? 蛋白質(zhì)印跡法又稱為免疫印跡法，這是一種用抗原抗體的特異性結(jié)合來檢測(cè)固定在固相載體上蛋白質(zhì)的免疫化學(xué)技術(shù)方法。 蛋白質(zhì)印跡（ western blotting）的概念 本文由探生科技技術(shù)人員提供 ,Fantibody全球抗體搜索引擎，您身邊的抗體專家 ! ? 將通過聚丙烯酰胺凝膠電泳分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素 /PVDF膜上，然后與能特異性識(shí)別待檢測(cè)蛋白的一抗（針對(duì)待測(cè)分子的單克隆抗體或多克隆抗體）進(jìn)行反應(yīng)； ? 洗滌去除沒有結(jié)合的特異性抗體后，加入二抗（針對(duì)一抗的抗體，標(biāo)記有放射性同位素或生物素）； ? 反應(yīng)一段時(shí)間后再次洗滌去除非特異性結(jié)合的標(biāo)記抗體，加入適合標(biāo)記物的檢測(cè)試劑進(jìn)行顯色或發(fā)光等，觀察有無特異性蛋白條帶的出現(xiàn)，也可通過條帶的密度大小來進(jìn)行特異性蛋白的半定量。 蛋白印跡基本步驟 本文由探生科技技術(shù)人員提供 ,Fantibody全球抗體搜索引擎，您身邊的抗體專家 ! 1. 固體相上的蛋白質(zhì) 2. 針對(duì)蛋白質(zhì)的特異性抗體，稱為一抗 3. 帶上辣根過氧化物酶針對(duì)一抗的抗體，稱為二抗 4. 加入底物，在酶的作用下，分解產(chǎn)生熒光 本文由探生科技技術(shù)人員提供 ,
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