中國人肥胖基因大腸桿菌中的表達(編輯修改稿)
2025-06-22 01:02 本頁面
【文章內容簡介】 IPTG/XGal體系篩選白色菌落，堿法快速抽提質粒，酶切后電泳鑒定重組質粒。用 ABI 377熒光自動測序儀進行 DNA順序分析 。 肥胖基因的分子克隆及 DNA順序分析 用測序載體 pUC19順利地對肥胖基因 PCR產物進行了克隆。通過 ABI 377熒光自動化測序， 證明其序列與報道的白種人完全一致 。 肥胖基因的原核表達 用 EcoR I和 Sal I將肥胖基因從 pUC19載體上切下，克隆入 六聚組氨酸融合表達載體pPROEX HTa 質粒 (圖 1)。 pPROEX HTa重組質粒轉化大腸桿菌 （ ） DH5α菌株并經酶切電泳鑒定。接種重組質粒的單菌落于 3 ml LB中， 37℃ 振搖培養(yǎng)過夜，按 1%比例轉接至30 ml LB中， 37℃ 振搖培養(yǎng) 3小時，使OD600約等于 ～ ，加入 IPTG至終濃度為 ，繼續(xù)培養(yǎng) 3小時，離心收集菌體，進行 SDSPAGE電泳 。 示意圖 ?將肥胖基因克隆入 pPROEX HTa六聚組氨酸融合表達載體，獲得表達的 蛋白分子量為 Kd，表達量高達 20%左右。 ?用所得的瘦蛋白可以進一步研究瘦素作用機制及治療肥胖癥和糖尿病。 在有些研究肥胖基因在大腸桿菌表達中，肥胖基因可在 不同大腸桿菌、不同 oD600值、不同時間誘導 等條件下表達，從而可以研究外源基因在大腸桿菌中的表達量的效率。 一． 實驗中我們曾分別用隨機引物和 P2引物來進行 RNA反轉錄，結果后者的 PCR得率要高得多。 測序結果表明運用 RTPCR方法從中國人脂肪組織獲得的肥胖基因序列與 Friedman實驗組報道的白種人完全一致， 可見該基因在人種間可能沒有差異 ，屬于高度保守序列，在功能上有極其重要的作用。 二． 對肥胖基因的原核表達，起初我們將肥胖基因克隆入 pBL220原核表達載體，但未獲得表達。后將其克
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