【正文】 應(yīng)該是首選方法。這種單管大引物法的優(yōu)點是：實現(xiàn)了在同一管中先后進行2輪PCR反應(yīng)，大幅簡化了操作步驟，并且省時、省力。例如：重疊延伸PCR法(Overlap Extension PCR簡稱EO—PCR)、大引物PCR法(Megaprimer PCR)、一步重疊延伸PCR(One—stepOverlap Extension PCR，簡稱OOE．PCR)、單管大引物PCR(Single—tube Megaprimer PCR)、快速定點誘變法、多位點環(huán)狀誘變法TAMS(Targeted Amplification of Mutant Strand)定點誘變技術(shù)?；蚬こ碳夹g(shù)的全部過程一般包括目的基因DNA片段的取得、DNA片段與基因載體的體外連接、外源基因轉(zhuǎn)入宿主細胞和目標基因的表達等主要環(huán)節(jié)。1972年美國的Berg和Jackson等人將猿猴病毒基因組SV 40DNA、λ噬菌體基因以及大腸桿菌半乳糖操縱子在體外重組獲得成功。二、 課程設(shè)計題目描述與要求本文介紹一種二十世紀七十年代發(fā)展起來的一種新型生物技術(shù)——基因工程，介紹其在育種中的應(yīng)用。利用這些技術(shù)，可以直接地、有針對性地在DNA分子水平上改造生物的遺傳性狀。(3)重組子體外構(gòu)建：主要方法有粘性末端連接法、平端連接法、人工接頭連接法和同聚物加尾連接法。該法省去了傳統(tǒng)上以PCR為基礎(chǔ)的定點突變中第1輪PCR產(chǎn)物的純化過程，實現(xiàn)了在同一管中先后進行2輪PCR反應(yīng)的定點突變目標。圖1 單管大引物PCR過程Figure 1 The process of Single圖2 TAMS定點誘變技術(shù)原理和操作過程Figure 2 The principle and operation process of TAMS1． 易錯PCRDNA聚合酶在進行擴增目的DNA時會以一定的頻率發(fā)生堿基錯配，這一現(xiàn)象恰好提供了一種對特定基因進行隨機誘變的可能方法。那些帶有同源性和核苷酸序列差異的隨機DAN片段在每一輪循環(huán)中互為引物和模板，經(jīng)過多次PCR循環(huán)后能迅速產(chǎn)生大量的重組DNA，從而創(chuàng)造出新基因。Ostermie等以核酸外切酶Ⅱ代替DNaseI對靶序列進行消化，發(fā)明了遞減法建立雜交酶技術(shù)（ITCHY)，使得非同源性序列間也能發(fā)生重排，擴大了該技術(shù)的用途。首先，利用經(jīng)典的誘變育種技術(shù)獲得含有目標性狀的基因組庫，然后利用原生質(zhì)體融合技術(shù)將這些發(fā)生正向突變的菌株的全基因組進行多輪隨機重組，從而快速篩選表型得到較大改進的雜交菌種。作為一種成熟的基因克隆表達受體，大腸桿菌被廣泛用于分子生物學(xué)研究的各個領(lǐng)域，如基因的分離擴增、DNA序列分析、基因的表達產(chǎn)物功能鑒定等。大腸桿菌表達系統(tǒng)具有生長快速、發(fā)酵成本低、表達水平高等優(yōu)點,是生產(chǎn)外源蛋白的理想表達體系。培養(yǎng)基配制所用蛋白胨和酵母抽提物均為Oxoid產(chǎn)品,其余試劑為國產(chǎn)分析純,采用去離子水配制。C，,通氣量4 L/min，初始攪拌轉(zhuǎn)速為400 r/min,發(fā)酵過程中轉(zhuǎn)速逐漸提高以維持溶氧大于20%。hIFNa2b的電泳測定采用三(羥甲基)甲基甘氨酸(φ=)SDS聚丙烯酰胺三層膠系統(tǒng)分離目的蛋白[6],凝膠用考馬斯亮藍染色,用圖像分析系統(tǒng)(Smart View analysis program,上海復(fù)日科技有限公司)定量。誘導(dǎo)后1 h,hIFNa2b比生產(chǎn)速率為162 mg/(g此補料分批發(fā)酵實驗記為FB1,結(jié)果見圖7和表1。后期hIFNa2b表達速率明顯減慢,發(fā)酵末期僅為10 mg/(g圖8　恒pH補料分批培養(yǎng)(FB1)中葡萄糖濃度(■)、葡萄糖流加速率(◆)及葡萄糖比消耗速率(▲)的變化曲線　Profiles of residual glucose(■), feeding rate of glucose (◆) and specific consumption rate of glucose(▲) in pHstat fedbatch cultivation (FB1),表明葡萄糖供應(yīng)的改善提高了hIFNa2b的表達水平, g/(g h補充有機氮源(酵母提取物25 g),以滿足菌體生長和產(chǎn)物合成的需要。分批發(fā)酵和不同補料分批發(fā)酵的實驗結(jié)果歸納于表1。參考文獻：[1] : 華東理工大學(xué)出版社,2005,8[2] 朱筠,李志敏,張倩,甘人寶,(pBAI),2008,3(2):184188[3] 聶明,李懷波,萬佳蓉,，2005,21(3):184187[4] 王參軍,鄒文藝,張玲,范清林,宋禮華. 突變?nèi)烁蓴_素α2b基因5′,2010,45(2):149153[5] 代云見,王明蓉,(國外醫(yī)藥抗生素分冊),2008,29(5):193200[6] 王海波,申燁華,(自然科學(xué)版),2003,33(2):174178[7] 鄒鐘誠,侯劍英,王增學(xué),、,1999,19(1):2426[8] 周鳴南,方深高,陶征宇,1995,26(4):152155[9] 黨建章,鄭雄敏,1995,19(4):380384 15