基因工程重組人干擾素概述(參考版)
2025-06-30 02:46本頁面
【正文】 相信在不久的將來 , 基因工程方法生產(chǎn)的干擾素會在疾病的診斷及治療方面發(fā)揮更大的作用 , 同時(shí)也成為生命科學(xué)研究中的一種有效的工具。 IFN 成為第一個上市的基因工程藥物 , 也是一種人們可以用得起的生物活性藥物 , 標(biāo)志了基因工程從實(shí)驗(yàn)室研究進(jìn)入醫(yī)藥臨床實(shí)踐 , 因此是生命科學(xué)發(fā)展歷程中的一個里程碑。 ③在試管中組織相關(guān)性淋巴細(xì)胞增生的放大中發(fā)揮作用 , 利用這個性質(zhì)可以研究器官移植中細(xì)胞因子的活動情況 , 并可用于診斷和治療。狗的 IFN γ與細(xì)胞因子和細(xì)胞嵌合后可以被抗干擾素的單克隆抗體所識別 , 并且有如下應(yīng)用 : ①水泡性口炎病毒噬菌斑抑制實(shí)驗(yàn) 。在 [ γ ,32p]ATP 存在的情況下 , 干擾素被 32p 標(biāo)記且不影響其活性。通過重組 IFN 噸 C 的抑制增生作用可以防止骨髓異常增生引起的血小板過量溶解。重組 IFN γ與重組 TNF α聯(lián)合用于腫瘤治療也已完成 I 期臨床工作。3. 抗腫瘤通過與糖基化的淋巴細(xì)胞毒素嵌合 ,IFN γ可以提高小鼠對 HT1080 纖維肉瘤、 G,361 惡性黑色素瘤、 ZR751 乳腺瘤等腫瘤的抗性。2. 提高免疫系統(tǒng)機(jī)能在小鼠實(shí)驗(yàn)中重組 IFN γ對 NK 細(xì)胞的活性、吞噬細(xì)胞的溶解性、絲裂原誘導(dǎo)的母細(xì)胞化均有促進(jìn)作用 , 同時(shí)減少外周血及骨髓量。第三節(jié)應(yīng)用一、臨床治療方面干擾素作為較早被研究的用基因工程方法合成的生物活性物質(zhì) , 雖然在基因的調(diào)取、構(gòu)建、表達(dá)方面仍有較多的工作在進(jìn)行中 , 但研究的熱點(diǎn)已經(jīng)轉(zhuǎn)移到了臨床應(yīng)用及臨床前的動物實(shí)驗(yàn)方面 , 并且在較多疾病的治療方面取得了進(jìn)展。3. 改變抗原性的干擾素如將 IFN 仇的 141 位上 Cys 用 Tyr 代替 , 則其抗原性發(fā)生改變 , 不與體內(nèi)自然存在的 IFN 在 1 爭奪受體 , 雖然這種抗原性改變的機(jī)率很小 , 但仍不失為一種研究方向。此外 , 如上面介紹的將 IFN 與 TNF 結(jié)合 , 可以產(chǎn)生不同的活性。新型雜合的 IFN α D 對 NK 細(xì)胞的調(diào)節(jié)能力比親本提高了 10~400 倍 , 如將 IFN α 4 與 IFNtl 進(jìn)行嵌合 , 得到的 IFN 活性分別是親代的 4 倍及 20 倍。將病毒對照組與細(xì)胞對照組進(jìn)行比較便可以測得其抗病毒活性。用不同稀釋度的 IFN 溶液加入各孔后再培養(yǎng) 7 h 。2. 抗增生活性在含 15% 小牛血清的 RPMI1640 培養(yǎng)基中培養(yǎng) 5 104 個 /ml Dauda 細(xì)胞 ,48h 后加入 IFN, 再培養(yǎng) 72h, 用 2BI 型庫爾特計(jì)數(shù)器對細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù) , 即可以得到 IFN 的抗增生活性。 24h 后 9000r/ min 離心 2min, 并將沉淀分散于 500 μ L 冷的含 20mmoiAEfEP ES 、 5mmol/L MgCl2 、 I20mmol 只 L KCl 、 7mm014 二硫蘇糖醇、 10% 甘氨酸、 05%NP40() 的裂解液中 , 冰浴 2min 后 9OOOr/min 離心 8IIlino 取上清與 50 μ L poly(rI):poly(rC) 瓊脂在 30 ℃共浴 15min, 離心去除未吸附部分 , 而將結(jié)合物與 [ α 32p]ATP 及磷酸激酶在 30 ℃水浴 20h 。五、活性檢測1. 對 (3 二 539。最后用 pH 的 GlyHCl 再生 , 用含 % 間的 PBS 沖洗凈 ,4 ℃保存。用 PBS 反復(fù)洗柱 , 至流出液的 1 吸收回到基線。將 Sepharose4B 與純化的抗 IFN α單克隆抗體混合振搖 , 室溫放置 4h 后低速離心 , 并用 () 的緩沖液洗去未結(jié)合的抗體 , 加入等體、積的乙醇膠并振蕩 4h 以上 , 將殘存的活性基團(tuán)加以封閉 O : 用 pH 的醋酸鹽緩沖液及 pH 的 TrisHCl 緩沖液交 i替洗滌 3 次 , 并用 pH 的 加以平衡 1 后裝柱。將 IFN 基因置于 Tetr 基因的上游 , 有利于轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的篩選和保持 ( 圖 126)O其中合成的啟動區(qū)序列為 :E∞R I35 區(qū)10 區(qū)GAAITCAAAAATrrA τTTGCTT τ℃ AGGAAAAATTTTI ℃IGTATAATE 丑 nd 皿AGAI τ℃ ATAAATTTGAAGCTAGGAGGTTTAAGCTT啟動子核糖體結(jié)合位點(diǎn)四、提取、純化及鑒定對干擾素的提純可分為粗提和進(jìn)一步純化 , 以 IFN α為例 , 粗提時(shí)將菌液 5000r/min 離心取細(xì)胞 , 加入 1/100 體積的 7mol/L 鹽酸肌冰浴 2h 裂解細(xì)胞后 17000r/min 離心 5min, 取上清液。如利用含噬菌體 T5 早期啟動子及強(qiáng)核糖體結(jié)合位點(diǎn)的高效轉(zhuǎn)錄二表達(dá)體系 , 可
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