基因工程及其在大腸桿菌生產(chǎn)人干擾素中的應(yīng)用-閱讀頁
2024-08-24 04:30本頁面
【正文】 測定試劑盒(上?？菩郎锛夹g(shù)研究所)測定。hIFNa2b的電泳測定采用三(羥甲基)甲基甘氨酸(φ=)SDS聚丙烯酰胺三層膠系統(tǒng)分離目的蛋白[6],凝膠用考馬斯亮藍染色,用圖像分析系統(tǒng)(Smart View analysis program,上海復(fù)日科技有限公司)定量。C下離心10 min,得到的菌體用TrisHCl緩沖液(50 mmol/L, pH ,4176。 結(jié)果與討論 分批發(fā)酵在5 L罐中分批培養(yǎng),結(jié)果見圖6和表1。分批發(fā)酵中葡萄糖耗完時, g/L。誘導(dǎo)后1 h,hIFNa2b比生產(chǎn)速率為162 mg/(gh)；誘導(dǎo)后期比生產(chǎn)速率下降至95 mg/(gh)。恒pH流加葡萄糖 培養(yǎng)4 h后升溫誘導(dǎo)表達hIFNa2b, g/L。此補料分批發(fā)酵實驗記為FB1,結(jié)果見圖7和表1。與分批發(fā)酵相比較,升溫誘導(dǎo)時( h)菌體處于對數(shù)生長前期,培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)充分,而本實驗中于4 h升溫誘導(dǎo)時菌體處于對數(shù)生長后期,培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)已經(jīng)被大量消耗,難以維持對數(shù)期的比生長速率。圖7 恒pH補料分批培養(yǎng)(FB1)中菌體(◆)、葡萄糖(■)、乙酸(●)及hIFNa2b(▲)的變化曲線 Profiles of dry cell weight (◆), residual glucose(■),acetic acid (●) and hIFNa2b (▲) in pHstatfedbatch cultivation (FB1) h達到2 400 mg/L,是分批發(fā)酵的3. 2倍。h),生產(chǎn)速率高達730 mg/(L后期hIFNa2b表達速率明顯減慢,發(fā)酵末期僅為10 mg/(g在恒pH補料分批培養(yǎng)中,能較好地控制葡萄糖的流加,使得發(fā)酵后期沒有乙酸積累。如圖8所示, g/, g/(gh),限制了hIFNa2b的表達。圖8 恒pH補料分批培養(yǎng)(FB1)中葡萄糖濃度(■)、葡萄糖流加速率(◆)及葡萄糖比消耗速率(▲)的變化曲線 Profiles of residual glucose(■), feeding rate of glucose (◆) and specific consumption rate of glucose(▲) in pHstat fedbatch cultivation (FB1),表明葡萄糖供應(yīng)的改善提高了hIFNa2b的表達水平, g/(gh)。誘導(dǎo)前培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)消耗較多, h1,升溫誘導(dǎo)后1 h, h1,營養(yǎng)消耗導(dǎo)致hIFNa2b的比生產(chǎn)速率僅27 mg/(g通過恒速補糖方式取得了hIFNa2b非常高的表達量,但這是通過延長發(fā)酵時間和提高菌體濃度實現(xiàn)的,過低的比生產(chǎn)速率大大影響發(fā)酵生產(chǎn)效率。 h補充有機氮源(酵母提取物25 g),以滿足菌體生長和產(chǎn)物合成的需要。h))的方式補充葡萄糖,發(fā)酵過程記為FB3,結(jié)果見圖9和表1?？梢钥闯?加入酵母抽提物,滿足了菌體生長的需要,使得誘導(dǎo)前后均有較高的比生長速率, h1。h),hIFNa2b的平均生產(chǎn)速率大幅提高,達1 006 mg/(L分批發(fā)酵和不同補料分批發(fā)酵的實驗結(jié)果歸納于表1。1) DCW at the beginning of inductionb；2) DCW at the end of culture3) During 1 h post induction；4) Overall productivity of hIFNa2b；5) Overall specific productivity of hIFNa2b；6) HIFNa2b yield based on total plex nitrogen sources；7) Specific hIFNa2b production3 結(jié) 論目前hIFNα2b在臨床的應(yīng)用廣泛,需求量大,但由于生產(chǎn)水平的限制,價格仍舊較高。分批培養(yǎng)時乙酸積累,對hIFNa2b表達有一定抑制作用,流加葡萄糖的策略使得表達期無乙酸積累,提高了hIFNa2b的表達水平。恒比供應(yīng)速率流加葡萄糖并在誘導(dǎo)前添加酵母抽提物,雖然總表達量5 530 mg/L,稍低于恒速流加方式,但是平均hIFNa2b生產(chǎn)速率高達1 006 mg/(L參考文獻：[1] : 華東理工大學(xué)出版社,2005,8[2] 朱筠,李志敏,張倩,甘人寶,(pBAI),2008,3(2):184188[3] 聶明,李懷波,萬佳蓉,，2005,21(3):184187[4] 王參軍,鄒文藝,張玲,范清林,宋禮華. 突變?nèi)烁蓴_素α2b基因5′,2010,45(2):149153[5] 代云見,王明蓉,(國外醫(yī)藥抗生素分冊),2008,29(5):193200[6] 王海波,申燁華,(自然科學(xué)版),2003,33(2):174178[7] 鄒鐘誠,侯劍英,王增學(xué),、,1999,19(1):2426[8] 周鳴南,方深高,陶征宇,1995,26(4):152155[9] 黨建章,鄭雄敏,1995,19(4):380384 15
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