【正文】 采用較弱的啟動(dòng)子或局部誘導(dǎo)強(qiáng)啟動(dòng)子的方法可降低蛋白質(zhì)合成的速 第八十七頁，共八十七頁。這是因?yàn)榇竽c桿菌細(xì)胞質(zhì)微環(huán)境的氧化復(fù)原態(tài)勢(shì)不利于蛋白質(zhì)二硫鍵的形成，而且缺少一種形成二硫鍵所必須的體系。菌體啟動(dòng)子控制的基因的轉(zhuǎn)錄到達(dá)很高的水平。 五、大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)研究的開展趨勢(shì) 第八十六頁，共八十七頁。其中需要研究的主要問題有 : 如何使肽酰甘氨酸酰胺化酶在大腸仟菌內(nèi)有較高的活力和專一性 。 五、大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)研究的開展趨勢(shì) 第八十五頁，共八十七頁。 大腸桿菌外表表達(dá)技術(shù)的建立 主 要 通 過 三 條 途 徑 使 目 標(biāo) 蛋 白 呈 現(xiàn) 在 菌 體 外 表 : 把外源序列插入 LamB 、 OmpA、 PhoE 等外膜蛋白的膜外區(qū) 把外源蛋白導(dǎo)入大腸桿菌鞭毛或傘毛的結(jié)構(gòu)中 這二種方法適合表達(dá)一段長度小于 100 個(gè)氨基酸殘基的外源序列 ， 因?yàn)檩^大的外源序列的插入往往會(huì)使外膜蛋白不能形成原來的三維 結(jié)構(gòu) ， 影響它轉(zhuǎn)運(yùn)過程和在膜上的定位 。 在一定程度上能與噬菌體展示系 統(tǒng)相媲美 。 大腸桿菌外表表達(dá)技術(shù)的建立 膜蛋白基因在大腸桿菌中表達(dá)的技術(shù)逐漸成為研究的熱點(diǎn)領(lǐng)域 ，膜蛋 白表達(dá)技術(shù)的開展促進(jìn)了大腸桿菌外表表達(dá)技術(shù)的建立 。這一結(jié)果為天然信號(hào)肽優(yōu)化 改造的設(shè)計(jì)提供了很好的參考依據(jù)。 改造信號(hào)肽的序列和結(jié)構(gòu)，提高分泌效率 改造信號(hào)肽的序列和結(jié)構(gòu)，提高分泌效率 比較成功的例子是發(fā)現(xiàn)了把堿性磷酸酯酶基因 phoA 信號(hào)肽的疏水區(qū) 置換為多聚 Leu 殘基能明顯提高分泌效率。 采用較弱的啟動(dòng)子或局部誘導(dǎo)強(qiáng)啟動(dòng)子的方法可降低蛋白質(zhì)合成的速 率 ， 從而到達(dá)增加正確折疊重組蛋白質(zhì)的目的 。 五、大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)研究的開展趨勢(shì) 第八十一頁，共八十七頁。 PDl 對(duì)目標(biāo)蛋白的二硫鍵形成和正確折疊的促進(jìn)作用可以受到谷 胱甘肽的調(diào)節(jié)。 共表達(dá)人或小鼠的二硫鍵異構(gòu)酶、促進(jìn)二硫鍵形成和正確折疊 大腸桿菌周質(zhì)空間通過二硫鍵形成酶 DsbA 和 DsbB 二個(gè)蛋白維持適 當(dāng)?shù)难趸瘡?fù)原態(tài)勢(shì)使蛋白質(zhì)的二硫鍵形成。在有些情況下需要有多個(gè)蛋白因子共表達(dá)才能到達(dá)預(yù)期的目標(biāo)。 共表達(dá)與蛋白質(zhì)折疊過程密切相關(guān)的分子伴侶 包涵體是由于在新合成的大量目標(biāo)蛋白質(zhì)的折疊過程中，大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)參與折疊的蛋白因子的量不能滿足需要，無法形成正確的構(gòu)象而產(chǎn)生的，因此在大腸桿菌內(nèi)共表達(dá)與蛋白質(zhì)折疊過程密切相關(guān)的分子伴侶，折疊酶或硫氧還蛋白基因可以使目標(biāo)基因可溶性表達(dá)的比例明顯上升。 五、大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)研究的開展趨勢(shì) 構(gòu)建各種表達(dá)載體 建立新的表達(dá)系統(tǒng) 目前研究的重點(diǎn)完善現(xiàn)有的表達(dá)系統(tǒng)，解決表達(dá)系統(tǒng)中還存在的缺陷 等方面。 到目前為止 ， 能看出的大腸桿菌蛋白水解酶基因缺陷的突變株都巳被獲得 ， 其中一局部具有實(shí)際應(yīng)用的潛力 。 rpoH 基因編碼大腸桿菌 RNA 聚合酶的 r32 亞基 ， r32 亞基對(duì)大腸桿菌中多種蛋白水解酶的活力有正調(diào)控作用 。 構(gòu)建蛋白水解酶活力低的工程化宿主菌 對(duì)于以可溶性或分泌形式表達(dá)的目標(biāo)蛋日而言 ， 隨著發(fā)酵后期各種蛋白水解酶的累積 ， 目標(biāo)蛋白會(huì)遭到蛋白水解酶的作用而被降解 。 改變代謝流的方向 ， 通過共轉(zhuǎn)化把枯草桿菌 、 釀酒酵母的乙酰乳酸合成酶基因 alsS， 單胞菌的丙酮酸脫羧酶基因 pdc1 和乙醇脫氫酶基因 adh2 導(dǎo)入大腸桿菌 ， 使丙酮酸的代謝有選擇地向生成 3‘ 羥基丁酮或乙醇的方向進(jìn)行 。 從而降低菌體產(chǎn)生乙酸所要求的溶氧飽和度閥值 。 四、高效表達(dá)目標(biāo)基因的戰(zhàn)略和技術(shù) 第七十六頁，共八十七頁。 但從實(shí)際應(yīng)用上看 ， 這些措施都有一定的滯后效應(yīng) ， 難以做到比較精確的控制 。 這是高密度發(fā)酵工藝研究中最迫切需要解決的問題 。 目前常用的發(fā)酵方式有：恒定培養(yǎng)、流加補(bǔ)料培養(yǎng)、連續(xù)培養(yǎng)三種 第七十五頁，共八十七頁。 四、高效表達(dá)目標(biāo)基因的戰(zhàn)略和技術(shù) 高密度發(fā)酵和工程化宿主細(xì)胞 大腸桿菌高密度發(fā)酵是大規(guī)模制備重組蛋白質(zhì)過程中不可缺少的工藝步驟。 對(duì)蛋白質(zhì)序列進(jìn)行改造需要有根本的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù) ， 而目前這方面的數(shù)據(jù)庫還不完整 。 酶法本錢比較高且參加的酶蛋白還必須別離去除 。 融合表達(dá)使目標(biāo)蛋白的構(gòu)象與天然狀態(tài)不一樣 ， 導(dǎo)致生物比活力降低 ， 甚至沒有活性 。 主要表現(xiàn)為： 大腸桿菌對(duì)分子量較大的目標(biāo)蛋白的較運(yùn)和分泌效率一般比較低 ， 不能滿足大規(guī)饃制備的需要 。 四、高效表達(dá)目標(biāo)基因的戰(zhàn)略和技術(shù) 第七十三頁，共八十七頁。 對(duì)蛋白質(zhì)序列中的蛋白水解酶敏感區(qū)域和識(shí)別位點(diǎn)進(jìn)行改造 。 對(duì)分子量較小的目標(biāo)基因進(jìn)行融合表達(dá)或串聯(lián)聚合表達(dá) 。 四、高效表達(dá)目標(biāo)基因的戰(zhàn)略和技術(shù) 第七十二頁，共八十七頁。 通過對(duì)能看出大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)半衰期的蛋臼質(zhì)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 ， 發(fā)現(xiàn) N末 端為 Arg 、 Lys 、 Leu 、 Phe 、 Tyr 、 Trp 殘基的蛋白質(zhì) ， 含有 Pro Glu 、 Ser 、 Thr 豐富區(qū)的蛋白質(zhì)容易降解 ， 穩(wěn)定性較差 。 四、高效表達(dá)目標(biāo)基因的戰(zhàn)略和技術(shù) 第七十一頁，共八十七頁。 四、高效表達(dá)目標(biāo)基因的戰(zhàn)略和技術(shù) 第七十頁，共八十七頁。 因?yàn)橄∮忻艽a子存在的位置 、 分布的均勻性 、 mRNA 的二級(jí)結(jié)構(gòu)的不同決定了它對(duì)翻譯過程的影響是有差異的 。 人尿激酶原 ProUK， 新型組織纖溶酶原激活劑 NTA 等基因中都含有較多的 AGG 和 AGA 密碼子 ， 在大腸桿菌中直接表達(dá)的水平很低 ， 但在大腸桿菌中共表達(dá) tRNA Arg(AGG/AGA) 基因 argU 后 ， 這些基因的表達(dá)水平能明顯得到提高 。 在表達(dá)系統(tǒng)中共表達(dá)稀有密碼子 tRNA 基因 ， 以提高大腸桿菌細(xì)胞 內(nèi)稀有密碼子 tRNA 的豐度 四、高效表達(dá)目標(biāo)基因的戰(zhàn)略和技術(shù) 第六十九頁，共八十七頁。 共表達(dá)大腸桿菌稀有密碼子 tRNA 基因 由于同義密碼子的使用頻率與細(xì)胞內(nèi)對(duì)應(yīng)的 tRNA 的豐度有正比關(guān)系稀有密碼子對(duì)應(yīng)的 tRNA 的豐度很低 ， 有可能在翻譯過程中發(fā)生中止和移碼突變 。 現(xiàn)已說明的在大腸桿菌中的稀有密碼子有： 編碼 Arg 的密碼子 AGA、 AGG、 CGA、 CGG 編碼 Pro 的密碼子 CCC、 CCU、 CCA 編碼 Cys 的密碼子 UGU、 UGC。 四、高效表達(dá)目標(biāo)基因的戰(zhàn)略和技術(shù) 第六十七頁，共八十七頁。 這一方法通常適用于目標(biāo)基因 5’ 端序列容易形成二級(jí)結(jié)構(gòu) ， 而又不宜改變其序列的情形下 第六十六頁，共八十七頁。 在必要的情況下 ， 還可通過定點(diǎn)突變 ， PCR 等技術(shù)改變個(gè)別關(guān)鍵的堿基來破壞 mRNA 5’ 端的 “ 莖環(huán) 〞 結(jié)構(gòu) 。 核糖體結(jié)合位點(diǎn)本身和附近的序列決定了目標(biāo)基因 mRNA 5’ 端的二級(jí)結(jié)構(gòu) ， 研究說明討 mRNA 5’ 端形成的 “ 莖環(huán) 〞 結(jié)構(gòu)阻礙了 mRNA 與核糖體 30S 亞基的結(jié)合 ， 從而抑制了翻譯的起始 。 核糖體結(jié)合位點(diǎn)序列的變化對(duì) mRNA 的翻譯效率有顯著影響，具體表現(xiàn)為： SD 序列 UAAGGAGG 的翻譯效率要比 AAGGA 高 3～ 6倍 翻譯起始密碼 ATG 與 UAAGGAGG的最適距離是 6～ 8 個(gè)堿基長度， 與 AAGAA 的最適距離是 5～ 7 個(gè)堿基長度 ATG 與 UAAGGAGG 至少相隔 3 ～ 4個(gè)堿基，與 AAGAA 至少相隔 5 個(gè)堿基； mRNA 的翻譯才能進(jìn)行 ATG 與 SD 序列之間的堿基組成為 A， T 堿基豐富時(shí)， mRNA 翻譯效 率較高。 第六十四頁，共八十七頁。 第六十二頁，共八十七頁。這一插入位點(diǎn)附近的序列將成為核糖體結(jié)合位點(diǎn)的一局部，因此它對(duì)于構(gòu)建高效表達(dá)質(zhì)粒是至關(guān)重要的。 四、高效表達(dá)目標(biāo)基因的戰(zhàn)略和技術(shù) 表達(dá)質(zhì)粒的優(yōu)化和設(shè)計(jì) 共表達(dá)大腸桿菌稀有密碼子 tRNA 基因 提高目標(biāo)基因 mRNA 和目標(biāo)基因產(chǎn)物的穩(wěn)定性 高密度發(fā)酵和工程化宿主細(xì)胞 第六十一頁，共八十七頁。 目前成功的例子主要是采用以下方案 : 〔 1〕 與大腸桿菌本身的外泌蛋白基因融合表達(dá) 〔 2〕 與一些能提高細(xì)胞外膜通透性的因子融合或共表達(dá) 〔 3〕 改變培養(yǎng)基的成分 歸納現(xiàn)有的研究結(jié)果顯示這些方法僅對(duì)外泌分子量較小的蛋白有效 ， 而且外泌效率一般都比較低 。 第五十九頁，共八十七頁。 ⑵ 目標(biāo)蛋白從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)到周質(zhì)空間過程中信號(hào)肽被加工切除，有效地防止了 N 端附加的甲硫氨酸的產(chǎn)生。 目標(biāo)蛋白在周質(zhì)空間中表達(dá) 目標(biāo)蛋白在周質(zhì)空間中表達(dá)的優(yōu)點(diǎn) ⑴ 大腸桿菌周質(zhì)空間中自身蛋白質(zhì)的數(shù)量約為 100 種，只占菌體總蛋白數(shù)量的 4%。 第五十七頁，共八十七頁。 目標(biāo)蛋白與有親合配基的序列融合表達(dá)既可以提高別離純化的效率，又能在融合蛋白切離的過程中得到?jīng)]有附加甲硫氨酸目標(biāo)蛋白。 第五十六頁，共八十七頁。 ⑵ 在別離純化后在體外用外肽酶處理 。 第五十五頁，共八十七頁。 ⑵ 另外 ， 附加的甲硫氨酸也可能 改變蛋白質(zhì)的免疫性質(zhì)和藥理性質(zhì) 。 在細(xì)胞質(zhì)中直接表達(dá)不帶有前導(dǎo)序列的成熟蛋白質(zhì) 在細(xì)胞質(zhì)中直接表達(dá)不帶有前導(dǎo)序列的成熟蛋白質(zhì)需要起始密碼 ， 通常為編碼甲硫氨酸的 ATG。個(gè)相當(dāng)重要的工具 。 研究說明 trxB 缺陷株細(xì)胞質(zhì)的氧化復(fù)原態(tài)勢(shì)發(fā)生了變化 ， 蛋白質(zhì)在 trxB 缺陷株的細(xì)胞質(zhì)中能夠形成二硫鍵 。 一些需要通過二硫鍵的形成來維持其構(gòu)象的目標(biāo)蛋白在大腸桿菌的細(xì)胞質(zhì)中往往不能正確折疊 。 分泌型異源蛋白的表達(dá) 第五十三頁，共八十七頁。 在細(xì)胞內(nèi)表現(xiàn)為可溶性的蛋白質(zhì) 目標(biāo)蛋白以可溶性蛋白質(zhì)形式表達(dá)雖然可以防止包涵體復(fù)性帶來的問題 ， 但是也有一定的缺陷 ， 主要表現(xiàn)為大腸桿菌本身存在于細(xì)胞質(zhì)中的蛋白質(zhì)往往只含有少量的 ， 甚至沒有半胱氨酸殘基 。 能有效促進(jìn)包涵體溶解變性的試劑和條件包括： 清 洗 劑