【正文】 到蛋白水解酶的作用 。 通過對能看出大腸桿菌細胞內半衰期的蛋臼質的統(tǒng)計學分析 ， 發(fā)現 N末 端為 Arg 、 Lys 、 Leu 、 Phe 、 Tyr 、 Trp 殘基的蛋白質 ， 含有 Pro Glu 、 Ser 、 Thr 豐富區(qū)的蛋白質容易降解 ， 穩(wěn)定性較差 。 在細胞內有多肽碎片 、 突變的異常蛋白和外界物理因素的刺激的條件 下 ， 大腸桿菌細胞內的蛋白水解酶活力往往能到達比較高的水平 。 四、高效表達目標基因的戰(zhàn)略和技術 第七十二頁，共八十七頁。 提高目標蛋白的穩(wěn)定性的措施主要有： 利用蛋白轉運系統(tǒng)把目標蛋白最終累積在周質空間 ， 或分泌到培養(yǎng)基中 采用缺乏某些蛋白水解酶基因的缺陷株作為宿主菌 。 對分子量較小的目標基因進行融合表達或串聯聚合表達 。 共表達能提高特定目標蛋白穩(wěn)定性的輔助因子 ， 如分子伴侶基因 。 對蛋白質序列中的蛋白水解酶敏感區(qū)域和識別位點進行改造 。 在較低的溫度下培養(yǎng)菌體和優(yōu)化發(fā)酵條件 。 四、高效表達目標基因的戰(zhàn)略和技術 第七十三頁，共八十七頁。 但必須指出的是 ， 由于目標蛋白本身的性質和用途的不同 ， 上述幾種方法在使用上是受到一定的限制的 。 主要表現為： 大腸桿菌對分子量較大的目標蛋白的較運和分泌效率一般比較低 ， 不能滿足大規(guī)饃制備的需要 。 蛋白水解酶含量低的菌株往往代謝不旺盛 ， 生長速率慢 ， 使高密度發(fā)酵比較困難 。 融合表達使目標蛋白的構象與天然狀態(tài)不一樣 ， 導致生物比活力降低 ， 甚至沒有活性 。 融合蛋白和串聯聚合蛋白需要用酶或化學的方法切割出單體目標蛋白 。 酶法本錢比較高且參加的酶蛋白還必須別離去除 。 化學法比酶法本錢低 ， 但不少裂解試劑有毒性 。 對蛋白質序列進行改造需要有根本的蛋白質結構數據 ， 而目前這方面的數據庫還不完整 。 第七十四頁，共八十七頁。 四、高效表達目標基因的戰(zhàn)略和技術 高密度發(fā)酵和工程化宿主細胞 大腸桿菌高密度發(fā)酵是大規(guī)模制備重組蛋白質過程中不可缺少的工藝步驟。其目的是在單個菌體對目標基因的表達水平根本不變的前提下，通過單位體積的菌體數量的成倍增加來實現總表達量的提高。 目前常用的發(fā)酵方式有：恒定培養(yǎng)、流加補料培養(yǎng)、連續(xù)培養(yǎng)三種 第七十五頁，共八十七頁。 構建出產乙酸能力低的工程化宿主菌 高密度發(fā)酵后期由于菌體的生長密度較高 ， 培養(yǎng)基中的溶氧飽和度往往比較低 ， 氧氣的缺乏導致菌體生長速率降低和乙酸的累積 ， 乙酸的存在對目標基因的高效表達有明顯的阻抑作用 。 這是高密度發(fā)酵工藝研究中最迫切需要解決的問題 。 雖然在發(fā)酵過程中可采取通氧氣 ， 提高攪拌速度 ， 控制補料速度等措施來控制溶氧飽和度 ， 減少乙酸的產生 。 但從實際應用上看 ， 這些措施都有一定的滯后效應 ， 難以做到比較精確的控制 。 因此構建出產乙酸能力低的工程化宿主菌 ， 是從恨本上解決問題的途徑之一 。 四、高效表達目標基因的戰(zhàn)略和技術 第七十六頁，共八十七頁。 利用透明顫菌血紅蛋白能提高大腸桿菌在貧氧條件下對氧的利用率的生物學性質 ， 把透明顫菌血紅蛋白基因 vgb 導入大腸桿菌細胞內以增加其對溶氧的寬容度 。 從而降低菌體產生乙酸所要求的溶氧飽和度閥值 。 用基因敲除技術缺失大腸桿菌的磷酸轉乙酰酶基因 pta1 和乙酸激酶基因 ackA， 使從丙酮酸到乙酸的合成途徑被阻斷 。 改變代謝流的方向 ， 通過共轉化把枯草桿菌 、 釀酒酵母的乙酰乳酸合成酶基因 alsS， 單胞菌的丙酮酸脫羧酶基因 pdc1 和乙醇脫氫酶基因 adh2 導入大腸桿菌 ， 使丙酮酸的代謝有選擇地向生成 3‘ 羥基丁酮或乙醇的方向進行 。 四、高效表達目標基因的戰(zhàn)略和技術 第七十七頁，共八十七頁。 構建蛋白水解酶活力低的工程化宿主菌 對于以可溶性或分泌形式表達的目標蛋日而言 ， 隨著發(fā)酵后期各種蛋白水解酶的累積 ， 目標蛋白會遭到蛋白水解酶的作用而被降解 。為了使對蛋白水解酶比較敏感的目標蛋白也能獲得較高水平的表達 ，需要構建蛋白水解酶活力低的工程化宿主菌 。 rpoH 基因編碼大腸桿菌 RNA 聚合酶的 r32 亞基 ， r32 亞基對大腸桿菌中多種蛋白水解酶的活力有正調控作用 。 rpoH 基因缺陷的突變株己經被構建 ， 研究結果說明它能明顯提高目標基因的表達水平 。 到目前為止 ， 能看出的大腸桿菌蛋白水解酶基因缺陷的突變株都巳被獲得 ， 其中一局部具有實際應用的潛力 。 四、高效表達目標基因的戰(zhàn)略和技術 第七十八頁，共八十七頁。 五、大腸桿菌表達系統(tǒng)研究的開展趨勢 構建各種表達載體 建立新的表達系統(tǒng) 目前研究的重點完善現有的表達系統(tǒng)，解決表達系統(tǒng)中還存在的缺陷 等方面。這些研究工作主要包括 : 重組蛋白質的正確折疊、構象形成和分泌 菌體外表表達技術及其應用 重組蛋白質修飾加工研究 第七十九頁，共八十七頁。 共表達與蛋白質折疊過程密切相關的分子伴侶 包涵體是由于在新合成的大量目標蛋白質的折疊過程中，大腸桿菌細胞內參與折疊的蛋白因子的量不能滿足需要，無法形成正確的構象而產生的，因此在大腸桿菌內共表達與蛋白質折疊過程密切相關的分子伴侶，折疊酶或硫氧還蛋白基因可以使目標基因可溶性表達的比例明顯上升。 研究說明這種作用是具有專一性的，不同的目標蛋白需要不同類型的蛋白因子共表達。在有些情況下需要有多個蛋白因子共表達才能到達預期的目標。 五、大腸桿菌表達系統(tǒng)研究的開展趨勢 第八十頁，共八十七頁。 共表達人或小鼠的二硫鍵異構酶、促進二硫鍵形成和正確折疊 大腸桿菌周質空間通過二硫鍵形成酶 DsbA 和 DsbB 二個蛋白維持適 當的氧化復原態(tài)勢使蛋白質的二硫鍵形成。 共表達人或小鼠的蛋白質二硫鍵異構酶〔 PDl〕 PDl 能互補 dsbA 缺陷株，但在 dsbB 缺陷株中 PDl 失去原有的 功能 。 PDl 對目標蛋白的二硫鍵形成和正確折疊的促進作用可以受到谷 胱甘肽的調節(jié)。 PDI 具有的二硫鍵異構，交換功能有效地彌補了 DsbA 和 DsbB 功能上的缺乏，從而提高了目標蛋白正確折疊的比例。 五、大腸桿菌表達系統(tǒng)研究的開展趨勢 第八十一頁，共八十七頁。 降低蛋白質合成的速率 ， 從而增加正確折疊重組蛋白質 從 phoA 基因合成速率低的突變株中發(fā)現其分泌在周質空間的 phoA 基 因的產物 堿性磷酸酯酶比野生型菌株有顯著增加 ， 由于只有構象正 確的酶原才能被大腸桿菌蛋白轉運系統(tǒng)識別和分泌 ， 這一結果說明了目 標蛋白合成的速率能對其構象形成正確與否產生影響 。 采用較弱的啟動子或局部誘導強啟動子的方法可降低蛋白質合成的速 率 ， 從而到達增加正確折疊重組蛋白質的目的 。 五、大腸桿菌表達系統(tǒng)研究的開展趨勢 第八十二頁，共八十七頁。 改造信號肽的序列和結構，提高分泌效率 改造信號肽的序列和結構，提高分泌效率 比較成功的例子是發(fā)現了把堿性磷酸酯酶基因 phoA 信號肽的疏水區(qū) 置換為多聚 Leu 殘基能明顯提高分泌效率。說明信號肽核心部位疏水 性的增強有利于它與細胞膜的相互作用。這一結果為天然信號肽優(yōu)化 改造的設計提供了很好的參考依據。 五、大腸桿菌表達系統(tǒng)研究的開展趨勢 第八十三頁，共八十七頁。 大腸桿菌外表表達技術的建立 膜蛋白基因在大腸桿菌中表達的技術逐漸成為研究的熱點領域 ，膜蛋 白表達技術的開展促進了大腸桿菌外表表達技術的建立 。 外源蛋白質在菌體外表表達的優(yōu)點是大腸桿菌可直接用于制備疫苗 ， 進行生物催化和作為探針篩選藥物 。 在一定程度上能與噬菌體展示系 統(tǒng)相媲美 。 五、大腸桿菌表達系統(tǒng)研究的開展趨勢 第八十四頁，共八十七頁。 大腸桿菌外表表達技術的建立 主 要 通 過 三 條 途 徑 使 目 標 蛋 白 呈 現 在 菌 體 外 表 : 把外源序列插入 LamB 、 OmpA、 PhoE 等外膜蛋白的膜外區(qū) 把外源蛋白導入大腸桿菌鞭毛或傘毛的結構中 這二種方法適合表達一段長度小于 100 個氨基酸殘基的外源序列 ， 因為較大的外源序列的插入往往會使外膜蛋白不能形成原來的三維 結構 ， 影響它轉運過程和在膜上的定位 。 在脂蛋白 、 IgA 蛋白酶 、 ompA 基因的 N 端或 C 端融合外源基因 這種融合表達的方法對外源基因的限制條件就比較小 ， 其序列可在 50 到 500 氨基酸殘基長度的范圍內 。 五、大腸桿菌表達系統(tǒng)研究的開展趨勢 第八十五頁，共八十七頁。 重組蛋白質修飾加工研究 蛋白質 C末端酰胺化 和 側鏈糖基化 是常見的翻譯后修飾加工類型 目前 C末端酰胺化一般都是在體外通過 肽酰甘氨酸酰胺酶 把 C末端甘氨酸轉換為胺基 把其他微生物的肽酰甘氨酸酰胺化酶，真核生物糖基化過程所涉及的酶系導入大腸桿菌的設想很早就被提出，但這些工作都還在探索之中。其中需要研究的主要問題有 : 如何使肽酰甘氨酸酰胺化酶在大腸仟菌內有較高的活力和專一性 。 如何通過基因工程技術改道真核生物的糖基化多酶體系使其能整合到 大腸桿菌的染色體中和對耱基化位置、糖基種類和長度進行控制等。 五、大腸桿菌表達系統(tǒng)研究的開展趨勢 第八十六頁，共八十七頁。 內容總結 外源基因在大腸桿菌中的表達。菌體啟動子控制的基因的轉錄到達很高的水平。包涵體的溶解與變性的主要任務是拆開錯配的二硫鍵和次級鍵。這是因為大腸桿菌細胞質微環(huán)境的氧化復原態(tài)勢不利于蛋白質二硫鍵的形成，而且缺少一種形成二硫鍵所必須的體系。因為稀有密碼子存在的位置、分布的均勻性、 mRNA 的二級結構的不同決定了它對翻譯過程的影響是有差異的。采用較弱的啟動子或局部誘導強啟動子的方法可降低蛋白質合成的速 第八十七頁，共八十七頁。